Культура изолированных клеток и тканей

Объектом культуры in vitro могут быть различные ткани, взятые из различных частей растения. Чаще всего в изолированной культуре выращивают прокамбиальни ткани, содержащие первичный и вторичный камбий, сосудистую паренхиму корнеплодов и клубней. В последнее время особое значение приобрело культивирования тканей лекарственных растений (среди них раувольфия, дихроа, женьшень, диоскорея).

 

При культивировании растительных тканей предпочтение отдается тканям стебля и это не случайно: ткани стебля легко образуют Калюс, кроме этого из них значительно легче получить стерильную культуру. Кроме того ткани корня, клубней, луковиц более инфицированные, и получить с них стерильную культуру сложнее.

 

Культура эксплантаты корне-и клубнеплодов и сердцевины стебля используется для исследования индукции клеточных делений и первичных этапов дифференциации. В этом случае клетки, которые находятся на конечной стадии дифференциации, под влиянием ауксинов и цитокининов в условиях культуры in vitro переходят в дедиференцийований состояние и поновляють меристематических активность. А в дедиференциацийованих тканей можно вызвать дифференциацию на уровне гистогенеза и органогенеза.

 

Эксплантаты сердцевины табака. Для индукции клеточных делений в сердцевинной паренхиме табака нужны и ауксин, и цитокининов. Поэтому эту ткань используют для определения роли каждого из гормонов в индуцировании делений. В культуре ткани, полученной из сердцевины паренхимы табака, можно индуцировать образование меристем стеблевой апекса и получить растения-регенерантов. То есть, эксплантаты сердцевины табака можно использовать для изучения метаболизма клетки при прохождении ею цикла от специализированной ткани стебля в ткани стебля растения-регенерантов.

 

Кроме этого, эксплантаты сердцевины стебля табака используют для исследования в них индукции элементов проводящей системы - трахей.

 

Рост эксплантаты, взятых из различных участков стебля, сильно отличается. Поэтому для вычленения эксплантаты сердцевины стебля табака используют второе или третье междоузлия. Растения табака должны быть в фазе бутонизации - до цветения.

 

Эксплантаты культивируют на твердом или жидком среде, соблюдая условия физиологической полярности - апикальным концом вниз.

 

Эксплантаты клубней и корнеплодов. Для работы отбирают здоровые, не поврежденные вредителями корнеплоды и клубни. Однородность клеточного состава, синхронность порядке четкий ответ на воздействие индукторов разделения делают эксплантаты клубней и корнеплодов удобной системой для изучения метаболизма клетки при прохождении ею клеточного цикла и перехода из дифференцированного состояния в дедиференцийований. Эту модель используют для изучения индукции синтеза ДНК, белка и различных форм РНК, исследования ферментативной активности в разные фазы клеточного цикла. Клубни топинамбура состоят из сильно вакуолизирован клеток запасающей паренхимы. При посадке эксплантаты клубни на среду с ауксином (2,4-Д или ИОК) индуцируются клеточные деления с достаточно высоким уровнем синхронности, так как клетки клубни топинамбура, находящихся в состоянии покоя, находятся в Gi-фазе и при помещении в условия in vitro синхронно проходят последующие фазы клеточного цикла. Интенсивность роста кусочка ткани на питательной среде зависит от индивидуальных особенностей клубни или корня и обычно варьирует между корнями даже в пределах одного сорта. Рост ткани зависит также от положения эксплантаты по длине корнеплода: конечно, ткани, вичленени из верхней трети корнеплода, растут лучше.

 

Эксплантаты культивируют на твердом или жидком средах. О физиологической полярности, то эксплантаты корнеплодов моркови помещают на среду апикальной стороной вниз. В то же время для эксплантаты клубней топинамбура или картофеля соблюдения условий полярности не обязательно, а для того, чтобы полностью исключить ее влияние, можно помещать эксплантаты на среду Тангентально. Хотя есть мнение, что соблюдение условий полярности зависит от размеров эксплантаты: для достаточно больших эксплантаты-важно соблюдать условия полярности, а для очень маленьких - не обязательно.

 

Культура тканей побегов древесных пород используется в основном для ускоренного размножения. Для этого используют каллусных и клеточные культуры. Особое значение этот метод имеет для хвойных пород, а также тех древесных, которые трудно укореняются и прищиплюються обычным способом.

 

Перед введением в культуру побеги сначала стерилизуют. Установлено, что хранение побегов длиной 10-20 см в течение нескольких дней перед посадкой завернутыми во влажную тряпку в холодильнике снижает повреждение тканей побега стерилизующие веществами в результате закупоривания ведущих элементов подсыхающих соком.

 

Для получения каллуса с хорошим ростом лучше использовать младшие части побега или побеги молодых растений. В некоторых случаях (например в Coffea sp.) Способность образовывать каллуса присуща только молодым зеленым побегам.

 

Образование каллуса, хотя и в разной степени, отмечено во всех тканей побега (камбия, луба, древесины, сердцевины). Исследователи наблюдали пролиферацию высоко специализированных клеток смоляных ходов при культивировании фрагментов из 3-5 летних ветвей 14 видов сосны.

 

Однако чаще используют фрагменты стебля, содержащие камбий, что обусловлено высоким содержанием эндогенных цитокининов в таких эксплантаты, и их высокой регенерационной способностью. Камбиальные эксплантаты видов древесных растений могут образовывать Калюс не только на среде без цитокининов, но ауксинов, витаминов и аминокислот. Калюсоутворення на среде, содержащей только минеральные соли и углеводы (сахарозу или глюкозу) наблюдали на фрагментах побегов каштана (Castanea) и березы, на среде без ауксинов - у побегов плюща и маслины.

 

Установлено, что интенсивность калюсоутворення у побегов древесных зависит от сезона. На эксплантаты каштана калюсоутворення интенсивнее происходит весной, у сосны - на эксплантаты изолированных летом, у персика-в мае, июне. В листопадных пород максимальную пролиферацию в фрагментов обнаружены в течение октября - декабря, тогда как процесс калюсоутворення на эксплантаты вечнозеленых растений мало менялся в течение года.

 

Калюс камбиального происхождения ряда сортов и видов яблони и вишни образуется независимо от времени года, тогда как развитие паренхимных каллуса связан с сезоном. Основное направление исследований в области культуры тканей древесных - это изучение влияния различных факторов среды на калюсоутворення и индукцию морфогенеза в этих каллуса. Для образования каллуса на эксплантаты побегов древесных растений в большинстве случаев требуются повышенные концентрации ауксинов - 2,4-Д, НОК, ИОК (2-10 мг / л). Способность к калюсоутворення различна в разных тканей одного вида, а также различных видов. Самая низкая регенерационная способность у хвойных.

 

Индукция морфогенеза зависит от определенного соотношения ауксинов и цитокининов, довольно часто используют смесь кинетину и БАП. Но путем морфогенеза в каллусных или суспензионной культуры получено незначительное количество растений-регенерантов лиственных пород, а для хвойных пород такие сведения отсутствуют.

 

Для размножения тех видов древесных, из тканей побегов которых не удается регенерировать растений, целесообразно использовать эксплантаты из других органов (пыльца, зародыши, проростки, меристемы).

Загрузка...