Несколько описанных ниже примеров иллюстрируют некоторые подходы, разработанные для характеристики транскриптов и исследования уровня транскрипционной активности.

Картирование с помощью нуклеазы S1 позволяет не только определять старт и конечную точку транскрипции определенного гена, но и оценивать уровень транскрипционной активности этого гена. Процесс начинается с клонированного фрагмента гена, содержащего конечную точку, которая должна быть установлена. Вокруг нее выбирает два рестриктни сайты одной рестриктазы, и еще один другой, как показано на рис. 11.12. Первая рестриктазы вырезает фрагмент, оставляя одно цепные вырасти на 5-концах. Используя их как матрицу, фрагмент.

Кленовая ДНК-полимеразы и достраивает 3'-конце, присоединяя радиоактивно меченые нуклеотиды? в результате 3'-конце обеих цепей содержат метку. Чтобы избавиться одной из них, используют сайт другу рестриктазы, все еще остается внутри. Наконец имеем метку на 3'-конце только матричного цепи (который из цепей является матричным, надо знать при выборе рестриктаз или установить по конечному результату). Денатурация этого фрагмента дает радиоактивно меченый одноцепочечный зонд, для которого точно известны его длина и локализация в гене. На последних этапах проводят гибридизацию этого зонда с суммарным препаратом клеточной РНК в растворе? комплементарная часть соответствующей мРНК образует с зондом двойную спираль. После этого и используют нуклеазу S1, которая способна гидролизовать только одноцепную нуклеиновую кислоту. Для локализации конечной точки транскрипции остается определить точную длину полученного меченого фрагмента ДНК с помощью электрофореза: эта длина равна расстоянию от метки до конечной точки. Интенсивность полосы после электрофореза дает информацию о транскрипционные активность гена: чем выше интенсивность, тем больше мРНК содержалось в препарате, выделенном из клетки.


Загрузка...

Яндекс.Метрика Google+