Саузерн-блотинга. Мощным средством анализа сложных смесей ДНК о наличии там специфических элементов последовательности является блотгибридизация на нитроцеллюлозных фильтрах по Саузерн (Edward Southern). Название процедуры, которую схематично изображено на рис. 11.11, происходит от слова blotting (сопла): фрагменты ДНК разделяются с помощью гель-электрофореза (оставаясь невидимыми в геле), после чего на гель накладывают нитроцеллюлозный фильтр, а под и над этим Сэндвичем размещают фильтровальную бумагу и погружают нижний слой бумаги в щелочной раствор. Под действием капиллярных сил раствор поднимается до верхнего слоя бумаги,? Захватывая? при этом ДНК и перенося ее из геля на нитроцеллюлозу. Одновременно при этом ДНК денатурируется щелочью. В результате одноцепная ДНК оказывается на фильтре? среде, пригодном для дальнейшей гибридизации, а сам фильтр является точной репликой исходного геля. Так же можно перенести ДНК на нитроцеллюлозу, применив электрофорез в поперечном направлении? с геля на фильтр. Далее проводят обработку фильтра зондом? одноцепочечным фрагментом ДНК определенной последовательности, содержащий радиоактивную метку. Зонд гибридизуеться с комплементарной ДНК в определенных пор невидимых полосах, что можно зафиксировать с помощью авторадиографии.

Таким образом можно установить, например, наличие в геноме дополнительных копий последовательности, которые являются гомологичными уже известной, присутствие в неизученной геноме генов, гомологичных известным генам, присутствие специфических последовательностей ДНК в препаратах, полученных из белково-нуклеиновых комплексов. Примером одного из многочисленных применений Саузерн-блотинга является метод фингерпринтингу ДНК (DNA fingerprinting).

Метод основан на факте наличия в эукариотических геномах минисателитних повторов (см. главу 4)? небольших элементов последовательности, тандемно повторяющиеся в разных местах генома несколько раз. Распределение локусов по количеству повторов индивидуален так же, как отпечатки пальцев. С целью идентификации особи (или лица? В криминалистике, судебных делах и т.п.) геномной ДНК обрабатывают рестриктаз, что не имеет своих сайтов внутри повтора. Фрагменты разделяются путем электрофореза, осуществляется блотинга и гибридизация с радиоактивно меченым элементом последовательности минисателлиты. В результате на авторадиограми представлено специфический для особи набор фрагментов разной длины, то есть разного количества повторов минисателлиты? своеобразный молекулярный отпечаток (DNA fingerprint).


Загрузка...
Яндекс.Метрика Google+