Поскольку подавляющее большинство белков синтезируется клеткой в ??небольших количествах, простое выделение этих белков с целью их исследования является практически невозможным. Технологии рекомбинантных ДНК решают этот вопрос. Ген, кодирующий данный белок, можно клонировать, встроить (например, в бактериальную плазмиду) и заставить бактериальную культуру производить этот белок. Выделение и очистка белка по культуре биохимическими методами уже не является принципиальной проблемой, несмотря на его большое количество. Одну из простейших схем экспрессии белка в E. сoli изображена на рис. 11.9. Понятно, что эукариотический ген не имеет смысла вводить в прокариотических клетку? прокариоты не имеют системы сплайсинга.

Поэтому берут только кодируя часть гена, которую можно получить из библиотеки клонов кДНК. Используя подходящую рестриктазы и лигазы, нужную кДНК встраивают в плазмиду рядом с промотором? например, лактозного оперона (см. раздел 5). Осуществляют трансформацию рекомбинантной плазмиды в бактериальные клетки, в бактериальной культуры добавляют синтетический индуктор lac-оперона IPTG. Промотор активируется, и осуществляется транскрипция гена и трансляция белка.

Более эффективная двухстадийная система экспрессии использует промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7. В бактериальном геноме нет таких полимераз, ни соответствующих промоторов нет. В клетку вводятся два плазмидные вектора: один содержит lac-промотор и ген РНК-полимеразы Т7, другой? сильный промотор полимеразы Т7 вместе с геном белка, который должен быть экспрессированных. IPTG индуцирует экспрессию полимеразы, которая связывается только с промотором в составе второй плазмиды (других промоторов нет) и обеспечивает синтез большого количества белка. Изучение структуры и особенностей функционирования многих белков было бы просто невозможным без такой искусственной экспрессии. Кроме того, использование рекомбинантных ДНК для экспрессии белков открывает принципиально новые возможности: последовательность ДНК можно практически как угодно изменить и получить мутантные формы белка. К белкового гена можно пришить ген другого белка, который будет выполнять роль метки. Часть гена, который отвечает части белка (например, структурном домена) можно удалить, и получить редуцированный белок или отдельный домен для структурных исследований. Любой нуклеотид можно заменить на другой методами направленного мутагенеза, благодаря чему получить белок с аминокислотной заменой. Такие подходы имеют большое значение для изучения механизмов активности ферментов, специфического опознания белками других молекул подобное.


Загрузка...
Яндекс.Метрика Google+