Клонированный или амплифицированных фрагмент ДНК можно исследовать различными способами, однако найвичерпниший информацию дает установка нуклеотидной последовательности (sequence) фрагмента секвенирования. На рис. 11.8 показана схема наиболее популярного сегодня метода Сангер (Frederick Sanger). К одноцепочечной ДНК-матрице добавляется радиоактивно меченый праймер, полный набор дезоксинуклеозидтрифосфатів (dNTP), ДНК-полимераза и небольшое количество дидезоксинуклеозидтрифосфату одного из четырех типов (например, ddATP).

Дидезоксинуклеотид отличается тем, что содержит атом Н вместо ОН-группы не только при 2'-, а также и при 3'-атоме пентозы (см. рис. 3.2). Включение такого нуклеотида в цепь, которая синтезируется, приведет к остановке дальнейшего роста цепи из-за отсутствия 3 'ОН-группы на его конце (см. рис. 3.4). Поскольку ddATP присутствует в небольшом количестве, такое событие будет происходить в разных точках цепи? во всех, где аденин расположен напротив тимина в составе матрицы. Путем денатурации продуктов реакции получим набор меченых одноцепочечных фрагментов от праймера до конечного аденина. Длина этих фрагментов в нуклеотидах определит порядковый номер аденина в составе цепи.

С целью определения длины фрагментов проводят гель-электрофорез в денатурирующих условиях, на соседние лунки геля наносят также продукты синтеза в присутствии других дидезоксинуклеотидив. Как показано на рис. 11.8, после электрофореза и визуализации полос из такого геля можно прочитать нуклеотидную последовательность. В другом методе секвенирования методе Максама Гилберта (Allan M. Maxam, Walter Gilbert) вместо ферментативного синтеза применяют химическое разрезания цепи на нуклеотиде типа. Полученные фрагменты разной длины также разделяют с помощью электрофореза.


Загрузка...

Яндекс.Метрика Google+