Альтернативным и дополнительным к клонированию методом увеличения количества желаемого фрагмента ДНК амплификации является полимеразная цепная реакция (ПЦР или PCR Polymerase Chain Reaction). Практически ПЦР это реакция синтеза ДНК in vitro, которая повторяется много раз: синтезированные цепи становятся матрицами для синтеза в следующем цикле реакции. Для осуществления ПЦР нужно знать минимум короткие последовательности ДНК на концах того фрагмента, который должен быть амплифицированных.

Реакционная смесь содержит следовые количество исходной ДНК, избыточные количества двух синтетических праймеров к концам фрагмента, нуклеозидтрифосфаты четырех типов и ДНК-полимеразу Taq термофильные бактерии Thermus aquaticus. Использование именно полимеразы Taq обусловлено тем, что она не теряет своей активности при нагревании до высоких температур.

В первом цикле ПЦР (рис. 11.7) происходит нагрев смеси до 95 ° С (денатурация ДНК) и охлаждения до 60 ° С. После охлаждения до такой все еще достаточно высокой температуры цепи ДНК не ренатурують, но праймеры (поскольку они присутствуют в достаточно высоких концентрациях) находят свои комплементарные участки и связываются с ними. Полимераза Taq начинает работать, продлевая эти праймеры.

Все последующие циклы ПЦР (реакция осуществляется в автоматическом режиме на приборе, который называется амплификатором) заключаются в нагреве ванной смеси до 95 ° С, которое сменяется охлаждением до 60 ° С. После второго цикла будут вновь синтезированные две такие же молекулы, как после первого, а также две молекулы, которые изображены на рис. 11.7. После третьего цикла? две такие же молекулы, что и после второго, а также две молекулы, длина которых четко ограничена двумя праймерами (рис. 11.7). Далее количество таких коротких матриц будет расти, и после 30-го цикла их будет в миллион раз больше, чем выходных длинных матриц. ПЦР применяют также для амплификации мРНК в виде ее кДНК-копий после синтеза кДНК на мРНК с помощью обратной транскриптазы: вариант ПЦР, который обозначается как RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction). Аббревиатура RT-PCR используется также в другом смысле Real Time Polymerase Chain Reaction (другое обозначение: QRT-PCR Quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction): процедура, в которой амплификация ДНК сопровождается определением ее количества после каждого раунда с помощью флуоресцентных красителей.


Загрузка...

Яндекс.Метрика Google+