Ранее были рассмотрены принципы клонирования фрагмента ДНК. Но откуда берется этот фрагмент? Для того, чтобы работать с определенным участком ДНК (например, определенным геном) сначала осуществляют клонирование большого количества разнообразных фрагментов генома создают библиотеку клонов, среди которых уже ищут нужен.

Стандартная процедура создания библиотеки? метод дробовика (shotgun)? начинается с частичной (в течение ограниченного времени) обработки всей геномной ДНК определенной рестриктазы? таким образом, чтобы получить набор различных фрагментов, которые перекрываются, сере-дня длина которых составляет ~ 20 тыс. пар оснований (рис. 11.5). Все такие фрагменты встраивают в векторы, и осуществляют трансформацию. Бактерии высевают на твердую среду так, что каждая колония происходит от одной клетки. Итак, набор колоний? это набор разнообразных клонов, каждый из которых содержит один из фрагментов генома. Аналогично создают библиотеки клонов кДНК (комплементарная).

ДНК-копия молекулы мРНК). Для этого сначала выделяют суммарную мРНК из клеток определенного типа. Используя обратную транскриптазу и олиго (dT), которые являются комплементарными 3'-концевым polyA-хвостам мРНК, как праймеры, на этих мРНК синтезируют комплементарные цепи ДНК. Удаляют цепь РНК РНКазы и достраивают вторую цепь ДНК с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы И. Далее полученные молекулы кДНК подвергают клонированию. В отличие от геномной библиотеки, библиотека клонов кДНК содержит только кодирующие последовательности (экзоны) генов и только таких, которые являются активными в клетках данного типа.

Нужную нуклеотидную последовательность среди библиотеки клонов можно найти с помощью гибридизации клонированной ДНК с радиоактивномиченим ДНК-зондом (рис. 11.6). Колонии бактерий в чашке Петри переносят на нитроцеллюлозный фильтр? делают своеобразную реплику. Осуществляется лизис клеток, депротеинизация и денатурация ДНК в щелочном растворе. После высушивания фильтра одноцепная ДНК необратимо фиксируется на нем. Фильтр обрабатывают радиоактивно меченой ДНК определенной последовательности? зондом. Если зонд является комплементарным ДНК клона, происходит гибридизация? ренатурации двухцепочечной ДНК. Детектирование этого факта с помощью авторадиографии позволяет идентифицировать разыскиваемый клон.


Загрузка...

Яндекс.Метрика Google+