После выделения клонированного рекомбинантного вектора и разрезания его рестриктазы возникает проблема отделить фрагмент ДНК от вектора. С этой целью чаще применяют гель-электрофорез? чрезвычайно важный метод в молекулярной биологии.

Принцип электрофореза очень прост (рис. 11.4). Смесь фрагментов ДНК (или РНК) наносят лунку пластинки геля? среды, сформированного полимерной сеткой. Обычно гель изготавливают на основе агарозы или полиакриламида. Через него пропускают электрический ток, благодаря чему отрицательно заряженные молекулы нуклеиновой кислоты движутся в электрическом поле. Полимерная сетка геля создает для этого движения существенное сопротивление, которой преодолевается тем легче, чем меньше размер фрагмента. Через некоторое время фрагменты разделяются на зоны? полосы геля, содержащие гомогенный набор фрагментов одного размера. Для визуализации полос гель окрашивают флуоресцентным красителем (чаще всего используют бромистый етидий), который связывается с ДНК. После этого полосу можно вырезать из геля, и экстрагировать ДНК.

Гель-электрофорез широко используют также как аналитический средство с целью выяснения состава смеси. Для визуализации полос (особенно если разделывают небольшие количества ДНК) часто применяют радиоактивное мечение ДНК путем ввода радиоактивного изотопа 32Р в состав 5-конечных фосфатных остатков. После электрофореза осуществляется авторадиография: на гель накладывают фото-пластинку, которая загорается напротив полос вследствие их радиоактивности. Альтернативой авторадиографии является экспонирование геля на специальную фосфорный экран, который затем сканируется соединенным с компьютером прибором? фосфоримиджером. Помимо высшего, если сравнивать с авторадиография, чувствительности, использование фосфоримиджера имеет то преимущество, что позволяет со значительно более высокой точностью оценивать количество материала в смузи.У простейшем варианте? для разделения фрагментов двухцепочечной.

ДНК по размеру? чаще используют агарозном геле. Полиакриламидный гель (ПААГ) имеет значительно разнообразнее применения. В частности, именно ПААГ используют для разделения смесей белков. Самым популярным является вариант электрофореза белков в присутствии додецилсульфата натрия? заряженного детергента, который разворачивает полипептидная цепь и покрывает его своеобразной? шубой?. В результате происходит разделение цепей разной длины по принципу, что иллюстрирует рис. 11.4. На подвижность макромолекул при электрофореза влияет также их форма. Соответственно, с помощью электрофореза можно, в частности, разделить:

• Молекулы ДНК, содержащие перманентные изгибы, обусловленные особой последовательностью пар оснований? изогнутая ДНК большей степени тормозится полимерной сеткой геля. • Циркулярные и линейные молекулы ДНК, а также отдельные циркулярные топоизомеры (см. раздел 3), поскольку они различаются по степени компактности.

• Молекулу свободной ДНК и комплекс этой ДНК с белком? понятно, что комплекс более тормозится сеткой геля. Особым вариантом электрофореза нуклеиновых кислот является электрофорез одноцепочечных фрагментов ДНК в денатурирующих условиях (повышенная температура, высокая концентрация мочевины). Если такой гель (полиакриламидный) достаточно тонкий (~ 0,4 мм? Секвенуючий гель), он позволяет разделить фрагменты, длина которых отличается на один нуклеотид.


Загрузка...

Яндекс.Метрика Google+