Первая проблема, которая встает перед исследователем, это получение в достаточном количестве предмета своего исследования. Эффективным под ходом, что позволяет размножить любой конкретный фрагмент ДНК, есть техника клонирования этой ДНК в бактериальных клетках: фрагмент интересует, встраивается в ДНК-вектор с образованием рекомбинантной молекулы ДНК, которая вводится в клетку (так называемая трансформация). Далее остается подождать роста бактериальной культуры? бактерия используется как своеобразный биореактор.

Как вектор часто используют бактериальные плазмиды сравнительно небольшие циркулярные молекулы ДНК, существующие в клетке независимо от бактериальной хромосомы. Основными требованиями к плазмиды как вектора является наличие в ее составе ориджина репликации, уникального (одного на плазмиду) сайта, что узнается определенной рестриктаз, и гена устойчивости к одному из антибиотиков (рис. 11.1).

Рестриктазы? специфические для небольших элементов последовательности эндонуклеазы, осуществляющие разрезание обеих цепей ДНК. Названия рестриктаз (существует несколько сотен таких ферментов) образуют по следующему принципу: первая большая буква обозначает род микроорганизма, две маленькие? вид, римские цифры и иногда большие буквы? порядковый номер рестриктазы среди других рестриктаз данной бактерии. Например, EcoRI? рестриктазы RI из Escherichia coli.

Сайтом рестрикции, что узнается рестриктаз, есть небольшие (четыре, шесть, иногда чуть больше пар оснований) палиндромный последовательности (см., например, сайт EcoRI на рис. 11.2). В зависимости от типа рестриктазы, два разреза, которые она осуществляет, могут быть расположены точно друг напротив друга в двух цепях, что приводит к образованию так называемых тупых (blunt) концов. Чаще рестриктазы оставляют взаимно комплементарные 5'-концевые (а иногда 3'-концевые) одноцепочечные вырасти (как на рис. 11.2)? липкие (sticky) концы.


Загрузка...
Яндекс.Метрика Google+