Методы генной инженерии позволяют не только осуществлять различные операции с нуклеиновыми кислотами, но и получать практически любые белки в больших количествах. Ген, кодирующий данный белок, можно клонировать, встроить (например, в бактериальную плазмиду) и заставить бактериальную культуру производить этот белок. Выделение и очистка белка по культуре биохимическими методами является принципиальной проблемой, несмотря на его большое количество. Одну из простейших схем экспрессии белка в E. сoli изображена на рис. 9.9. Понятно, что эукариотический ген не имеет смысла вводить в прокариотических клетку? прокариоты не имеют системы сплайсинга.

Поэтому берут только кодируя часть гена, которую можно получить из библиотеки клонов кДНК. Используя подходящую рестриктазы и лигазы, нужную кДНК встраивают в плазмидный вектор для экспрессии рядом с промотором например, лактозного оперона (см. раздел 2). Осуществляют трансформацию рекомбинантной плазмиды в бактериальные клетки, в бактериальной культуры добавляют синтетический индуктор lac-оперона IPTG. Промотор активируется, после чего осуществляется транскрипция гена и трансляция белка.

Более эффективная двухступенчатая система экспрессии использует промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7. В бактериальном геноме ни таких полимераз, ни соответствующих промоторов нет. В клетку вводятся два плазмидные вектора: один содержит lac-промотор и ген РНК-полимеразы Т7, другой? сильный промотор полимеразы Т7 вместе с геном белка, который должен быть экспрессированных. IPTG индуцирует экспрессию полимеразы, которая связывается только с промотором в составе второй плазмина (других промоторов нет) и обеспечивает синтез большого количества белка. ются в рекомбинантных технологиях, производимых сегодня путем экспрессии в бактериальных клетках. Наряду с прокариотической разрабатываются и используются также системы экспрессии рекомбинантных белков в эукариотических клетках. Особенно важными эукариотические сис-темы экспрессии является для эукариотических белков, которые не могут быть синтезированы бактериальной клеткой в ??активной форме. В частности, это касается белков, подвергающихся существенным посттрансляционной модификации? например, гликопротеидов. Простейшим для использования эукариотических "биореактором" являются дрожжи, манипулировать которыми так же легко и так же дешево, как и бактериями. Как дрожжевые експресуючих векторы используют плазмиды или искусственные хромосомы YAC.


Загрузка...
Яндекс.Метрика Google+