Клонированный или амплифицированных фрагмент ДНК можно исследовать различными способами

, но наиболее исчерпывающую информацию дает установка нуклеотидной последовательности (sequence) фрагмента секвенирования.

На рис. 9.6 показана схема популярного сегодня метода Сангер (Frederick Sanger). К одноцепочечной ДНК-матрице добавляется радиоактивно меченый праймер, полный набор дезоксинуклеозидтрифосфатів (dNTP), ДНК-полимераза и небольшое количество дидезоксинуклеозидтрифосфату одного из четырех типов (например, ddATP). Дидезоксинуклеотид отличается тем, что содержит атом Н вместо ОН-группы не только при 2'-, а также и при 3'-атоме пентозы (см. рис. 1.1).

Соответственно, включение такого нуклеотида в цепь, которая синтезируется, остановит дальнейший рост цепи вследствие отсутствия 3 'ОН-группы на его конце. Поскольку ddATP присутствует в небольшом количестве, такое событие будет происходить в разных точках цепи? во всех, где стоит аденин напротив тимина в составе матрицы. Денатурация продуктов реакции даст набор меченых одноцепочечных фрагментов от праймера до конечного аденина, длина этих фрагментов в нуклеотидах даст по порядковый номер аденина в составе цепи. С целью определения длины фрагментов проводят гель электрофорез одноцепочечной ДНК в денатурирующих условиях, на соседние лунки геля наносят также продукты синтеза в присутствии других дидезоксинуклеотидив. Как показано на рис. 9.6, после электрофореза и визуализации полос из такого геля можно прочитать нуклеотидную последовательность.

Другой современный подход в секвенирование (так называемое пиросеквенування), который реализуется на автоматизированных секвенатор, позволяет установить последовательность значительно быстрее, дешевле и при этом не требует ни клонирования ДНК, ни электрофореза. Одноцепочечные фрагменты, полученные из небольшого количества геномной ДНК, пришиваются своими 5-концами к микрокульок (один фрагмент на шарик) и подвергаются амплификации с помощью ПЦР. Каждый шарик с пришитыми к ней амплифицированных идентичными фрагментами размещается в микрореакторы, где осуществляется ДНК-полимеразная реакция. Нуклеозидтрифосфаты подаются в реакционную смесь импульсно друг за другом. Если нуклеотид типа оказывается комплементарным матрице и включается в растущий цепь, пирофосфат, что при этом освобождается, привлекается к ряду химических реакций, где последняя реакция сопровождается излучением света (хемилюминесценции). Световой сигнал фиксируется оптической системой, и последовательность таких сигналов читается как нуклеотидная последовательность. Реакция осуществляется параллельно в 200 тыс. микрореакторы (для 200 тыс. фрагментов, которые перекрываются), что позволяет установить последовательность около 200 млн пар оснований за 4,5 часа.

Понятно, что далеко не всегда есть необходимость в определении последовательности ДНК, с которой имеет дело исследователь. Мощным средством анализа сложных смесей ДНК о наличии там специфических элементов последовательности является блот-гибридизация на нитроцеллюлозных фильтрах по Саузерн (Edward Southern). Название процедуры, которую схематично изображено на рис. 9.7, происходит от слова blotting (сопла): фрагменты ДНК разделяются с помощью гель-электрофореза (оставаясь невидимыми в геле), после чего на гель накладывают нитроцеллюлозный фильтр, а под и над этим "сэндвичем" размещают фильтровальную бумагу и погружают нижний слой бумаги в щелочной раствор. Под действием капиллярных сил раствор поднимается до верхнего слоя бумаги, "захватывая" при этом ДНК и перенося ее из геля на нитроцеллюлозу. Одновременно при этом ДНК денатурируется щелочью. В результате одноцепная ДНК оказывается на фильтр среде, пригодном для дальнейшей гибридизации, а сам фильтр является точной репликой исходного геля.

 


Загрузка...
Яндекс.Метрика Google+