Рассмотрены принципы клонирования фрагмента ДНК оставляют вопрос, откуда берется тот или иной фрагмент ДНК. Для того, чтобы работать с определенным участком ДНК (например, определенным геном) сначала осуществляют клонирование большого количества разнообразных фрагментов генома? создают библиотеку клонов, среди которых уже ищут нужен.

Стандартная процедура создания библиотеки? метод дробовика (shotgun)? начинается с частичной (в течение ограниченного времени) обработки всей геномной ДНК определенной рестриктазы? так, чтобы получить набор различных фрагментов, перекрываются, определенной средней длины (рис. 9.4). Все такие фрагменты встраиваются в векторы, после чего осуществляется трансформация. Бактерии высеваются на тверодниеи клетки. Итак, набор колоний? это набор разнообразных клонов, каждый из которых содержит один из фрагментов генома.

Аналогично геномных библиотек создают библиотеки клонов кДНК. Для этого сначала выделяют суммарную мРНК из клеток определенного типа. Используя обратную транскриптазу и oligoT, что комплементарные к 3'-концевых polyA-хвостов мРНК, как праймеры, на этих мРНК синтезируют комплементарные цепи ДНК. Далее полученные молекулы кДНК подвергают клонированию. В отличие от геномной, библиотека клонов кДНК содержит только кодирующие последовательности (экзоны) генов и только таких генов, которые являются активными в клетках данного типа. Нужную нуклеотидную последовательность среди библиотеки клонов можно найти с помощью гибридизации клонированной ДНК с радиоактивно меченым ДНК-зондом (рис. 9.5). Колонии бактерий в чашке Петри переносят на нитроцеллюлозный фильтр? делают своеобразную реплику. Затем осуществляют лизис клеток, депротеинизацию и денатурацию ДНК в щелочном растворе. После высушивания фильтра одноцепную ДНК необратимо фиксируют на нем. Фильтр обрабатывают радиоактивно меченой ДНК определенной последовательности? зондом. Если зонд комплементарный ДНК клона, происходит гибридизация? ренатурации двухцепочечной ДНК. Детектирование этого факта с помощью авторадиографии позволяет идентифицировать разыскиваемый клон.

Синтез зонда зачастую проводят, используя базу данных EST (Expressed Sequence Tag). База является обще доступной коллекцией большого количества коротких (200? 400 пар оснований) фрагментов последовательностей кДНК многих организмов. Достаточно найти в EST-базе короткий участок, соответствующий фрагменту последовательности белка (ген которого разыскивается), и синтезировать его, чтобы приготовить зонд.


Загрузка...
Яндекс.Метрика Google+