Методами клонирования любые фрагменты ДНК, полученные с помощью рестриктаз, можно встроить в плазмиду или ДНК бактериофага вектор для молекулярного клонирования, а затем размножить эти генетические элементы в клетках бактерий или дрожжей, увеличивая их количество в миллионы раз.

Необходимость использования вектора обусловлена ??тем, что при обычном введении ДНК в клетки она подвергается воздействию нуклеаз, которые расщепляют ее до нуклеотидов. Чтобы ДНК стала частью генетического аппарата клетки, она должна либо встроиться в ее геном, или быть способным к автономной репликации.

Как вектор для клонирования часто используют бактериальные плазмиды (раздел 5). Основными требованиями к плазмиды как вектора является наличие в ее составе ориджина репликации, уникального (одного на плазмиду) сайта, что узнается определенной рестриктаз, и гена устойчивости к одному из антибиотиков как селективного маркера (рис. 9.2). С целью создания рекомбинантной ДНК очищенную плазмиду, которая содержит единственный сайт определенной рестриктазы, обрабатывают этой рестриктазы и получают линейный вектор с липкими концами. Далее добавляют фрагмент ДНК, который был изъят с помощью той же рестриктазы. За счет комплементарной взаимодействия между липкими концами фрагмента и вектора образуется циркулярный нековалентных комплекс двух молекул ДНК. Благодаря использованию ДНК-лигазы полинуклеотидной цепи сшиваются? образуется рекомбинантная молекула ДНК.

Самыми удобными являются плазмидные векторы, содержащие так называемый полилинкер? участок с определенным набором уникальных рестриктних сайтов, что позволяет подобрать одну из рестриктаз, наиболее подходящую для каждого случая. Фрагменты ДНК с тупыми концами можно встроить в вектор с помощью лигазы, хотя такая реакция на порядок менее эффективна. С помощью терминальной трансферазы к 3'-концов фрагмента ДНК можно присоединить, например, одноцепочечный poly (A)-хвост, а к 3'-концов линейного вектора? poly (T). При смешивании между комплементарными одноцепочечным концами состоится спаривания, окончательное сшивание завершает ДНК-лигаза. Таким образом можно объединять любые фрагменты с тупыми концами, независимо от метода их получения.

Ферментативным путем можно создать тупые концы на фрагментах из липкими концами. Для этого либо осуществляют удаление одно-цепных выростов с помощью нуклеазы S1, или липкие концы застраивают с помощью фрагмента Кленова. Образовавшийся фрагмент с тупыми концами встраивают в вектор по уже описанным методом.

Трансформация бактериальных клеток рекомбинантной плазме дой осуществляется обычно в растворе CaCl2 или путем электропорации (через суспензию клеток проводится короткий импульс электрического тока). В обоих случаях повышается проницаемость клеточной стенки и рекомбинантная плазмида попадает внутрь. Далеко не все бактерии получают плазмиду при трансформации, и здесь становится полезным ген устойчивости к антибиотику: достаточно обработать бактериальную культуру этим антибиотиком, чтобы оставить только трансформированные клетки. Далее происходит автономная репликация плазмиды и размножение самих клеток, что приводит к значительному росту общего количества плазмид


Загрузка...
Яндекс.Метрика Google+