Главным инструментом для осуществления генно-инженерных операций являются природные ферменты, которые катализируют реакции деградации и синтеза нуклеиновых кислот. Особое место среди них принадлежит рестриктним эндонуклеазы (рестриктазами), осуществляющих специфическое разрезания молекулы ДНК внутри определенных элементов последовательности нуклеотидов.

Рестриктазы (существует несколько сотен таких ферментов) выполняют в бактериальных клетках роль защиты от чужеродной ДНК бактериофагов. Названия этих ферментов образуются по следующему принципу: первая большая буква обозначает род микроорганизма, две маленькие? вид, римские цифры и иногда большие буквы? порядковый номер рестриктазы среди других рестриктаз данной бактерии. Например, EcoRI? рестриктазы RI из Escherichia coli.

Последовательности нуклеотидов, которые узнаются рестриктазами, отличаются большим разнообразием: сайтом рестрикции есть небольшие (4, 6, иногда чуть больше пар оснований) палиндромный последовательности (которые читаются одинаково в направлении 5'-3 'по обеим цепям, рис. 9.1).

В зависимости от типа рестриктазы, два разреза, которые она осуществляет, могут быть расположены точно друг напротив друга в двух цепях, обуславливает образование так называемых тупых концов. Чаще рестриктазы оставляют взаимно комплементарные 5'-концевые (иногда 3'-концевые) одно-цепные вырасти? липкие концы Следующий важный для генной инженерии фермент? ДНК-зависимая ДНК-полимераза (см. раздел 1). Чаще всего используют ДНК-полимеразу и E. coli. Ей присущи три вида каталитической активности:

• полимеразная, что приводит синтез цепи ДНК в направлении
5 '? 3' на одноцепной ДНК-матрицы в присутствии четырех нуклеозидтрифосфатив и короткого ДНК-праймера, который имеет свободную 3'-гидроксильную группу;
• 3'-екзонуклеазна, которая вызывает отщепление нуклеотидов от 3'-конца с целью редактирования ошибок;
• 5-екзонуклеазна, что обеспечивает отщепление нуклеотидов от 5'-конца полинуклеотидной цепи.

За счет первой и третьей активностей ДНК-полимераза и одновременно может катализировать реакцию полимеризации и гидролиза нуклеотидного цепи в направлении 5 '? 3', начиная с одноцепочечной разрыва в двухцепная ДНК. Такой процесс называется ник-трансляцией: при этом разрыв (ник) перемещается вдоль цепи ДНК в направлении 5 '? 3' на расстояние до тысячи пар нуклеотидов. Ник-трансляцию используют, в частности, для введения в ДНК радиоактивно меченых нуклеотидов. От ДНК-полимеразы и с помощью трипсина или субтилизину можно отделить большой фрагмент (фрагмент Кленова), что сохраняет только полимеразную и 3'-екзонуклеазну активности. Отсутствие 5-екзонуклеазнои активности позволяет, в частности, использовать фрагмент Кленова для "заполнения" одноцепочечных 5'-концевых выступов, образующихся при разрезании ДНК рестриктазами.

Также используют ДНК-полимеразу фага Т4. Ей присущи те же активности, что и фрагмента Кленова, но ее 3'-екзонуклеазна активность является в 200 раз выше. Соответственно, эту полимеразу применяют для введения метки в рестриктив с выступлениями 3'-концов. ДНК-лигаза представляет собой еще один из важнейших инструментов генной инженерии. Она катализирует синтез фосфодиэфирных связи между 5'-фосфатным и 3'-гидроксильными концами в одном месте цепного разреза (ника) в двухцепная молекуле ДНК. Чаще всего используют ДНК-лигазы фага Т4, которая способна в присутствии АТР сшивать фрагменты ДНК из липкими концами: два взаимно комплементарные липкие концы образуют двойную спираль с двумя никами (рис. 9.1), которые зашиваются лигазы.


Загрузка...
Яндекс.Метрика Google+