Если молекула обладает суммарным зарядом q и находится в однородном электрическом поле E, то на нее действует сила F = qE. Как было показано в разделе "Трение макромолекул в растворе", скорость макромолекулы, на которую действует постоянная сила F, в растворе очень быстро достигает постоянной конечной величины v($) = F/f = qE/f. 

Однако такое упрощенное описание электрофореза (т.е. явления переноса заряженных частиц под действием электрического поля) хотя и приводится во многих учебниках, совершенно не соответствует реальной картине. Прежде всего возникает неопределенность с суммарным зарядом макромолекулы, который зависит от ионной силы раствора. При малом количестве противоионов макромолекула будет стремиться пере- мещаться в одну сторону, а противоионы - в другую. Энергия, которую пришлось бы затратить на преодоление электростатического притяжения при разделении зарядов, чрезвычайно велика, поэтому реально происходящая миграция макромолекул будет незначительна. При избытке противоионов электролит образует ионную атмосферу вокруг полимера, и для того, чтобы учесть этот эффект, можно использовать два подхода. При одном подходе считают, что ионная атмосфера уменьшает эффективный суммарный заряд макромолекулы. При другом полагают, что ионная атмосфера порождает электрическое поле, в котором находится макромолекула и которое следует учитывать наравне с внешним полем. Принято описывать эту атмосферу с помощью непрерывного распределения, игнорируя дискретный характер зарядов. Далее за счет движения макроиона и малых ионов ионное облако постоянно деформируется. Учет всех эффектов представляет собой очень трудную задачу. В результате, существующая теория электрофореза, несмотря на всю ее сложность, не в состоянии удовлетворительно объяснить экспериментальные данные по электрофорезу.

Несмотря на сложность теории, электрофорез является действенным и удобным средством анализа белков и нуклеиновых кислот, если не требовать от него количественных данных о структуре молекул. Все теории согласованно предсказывают, что подвижность прямо пропорциональна отношению суммарного заряда к коэффициенту трения. Такая за- висимость позволяет использовать электрофорез для получения информации об относительной величине заряда (для молекул, которые имеют одинаковые размеры и форму) или об относительных размерах (для молекул с одинаковыми зарядами). Существуют, однако, две разновидности электрофореза, которые могут дать некоторую количественную информацию о молекулах - это изоэлектрическое фокусирование и элект- рофорез в присутствии додецилсульфата натрия.

Изучение электрофоретической подвижности белков как функции pН методом изоэлектрического фокусирования позволяет найти изоэлектрическую точку молекулы, о важности которой как характеристики белка рассказано в разделе "Растворимость белков и нуклеиновых кислот" в предыдущей лекции. Этот метод, при котором в геле при добавлении смеси амфолитов под действием электрического поля создается градиент pН, является прямым аналогом равновесного центрифугирования в градиенте плотности. В этот градиент pН добавляют небольшое количество белка. Белковая молекула движется к катоду, если pН меньше значения ее изоэлектрической точки, или к аноду, если pН більше этого значения. Белок мигрирует, пока не достигнет pН, соответствующего его изоэлектрической точке. Там он концентрируется, образуя узкую зону.

Второй, очень популярный метод - это электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) - H3C-(CH2)10-CH2OSO3 -Na+. Здесь основная идея состоит в том, чтобы превратить все белки в молекулы со сходной структурой, которые отличались бы друг от друга лишь значениями молекулярной массы. ДСН - сильный денатурирующий реагент по отношению к белку. Он связывается со всеми белками примерно одинаково: 1.4 г на 1 г аминокислот. Каждая молекула ДСН несет один отрицательный заряд. Благодаря такому количеству ДСН в комплексе ДСН-белок общая плотность зарядов в комплексе более или менее одинакова для самых разных белков, несмотря на вариации в величине заряда исходных белковых молекул. Добавляемые дополнительно восстанавливающие реагенты, такие как b-меркаптоэтанол, разрывают все дисульфидные связи как внутри цепей, так и между разными цепями. В этих условиях уже ничто не мешает молекулам белка после денатурации находиться в тех равновесных формах, которые обусловлены взаимо- действиями в комплексе ДСН-белок. Гидродинамические измерения показали, что эти комплексы представляют собой вытянутые эллипсоиды или стержни постоянного сечения, диаметр которых составляет примерно 1.8 нм, а длина и молекулярная масса связаны линейной зависимостью для белков, мол. масса которых больше 15 кДа. Точность определения молекулярной массы белков таким методом обычно не превосходит 5%.

При любом обычном электрофоретическом опыте разрешение, достигаемое при разделении нескольких компонентов, зависит от двух факторов: ширины зоны образца в начале эксперимента и обусловленного диффузией размывания ее в процессе электрофореза. Диск-электрофорез (от английского "discontinuous" - прерывистый) позволил уменьшить ширину зоны исходного образца до нескольких мкм вместо нескольких см, получаемых при менее совершенных методиках электрофореза. Сущность метода состоит в использовании буферов с разными pН на концах геля. Гель состоит из трех областей:
1) стартовой области, в которую вводится исходная смесь макромолекул;
2) концентрирующей области и
3) разделяющей области, в которой происходит само разделение компонентов. Гель готовят на буферных растворах, которые используют в качестве электродных сред. Ионы, движущиеся во время электрофореза в одном направлении с фракционируемыми макромолекулами, разбивают на два класса - ведущие и замыкающие.

В начале электрофореза ведущие ионы находятся в геле, замыкающие – в электродном буфере. Когда через систему пропускают ток, ведущие (более подвижные из- за малого размера) ионы обгоняют макромолекулы и замыкающие ионы, оставляя за собой зону с меньшей электропроводностью. Известно, что удельная электропроводность обратно пропорциональна напряженности электрического поля, следовательно, в этой зоне напряженность будет повышена, что ускорит движение макромолекул и замыкающих ионов и заставит их двигаться вслед за ведущими. В системе установится регулируемое равновесие, т.е. между ведущими и замыкающими ионами возникает подвижная граница.

Так как у макромолекул подвижность меньше, чем у ведущих ионов, и больше, чем у замыкающих, то они будут концентрироваться в узкой зоне, фронтом которой и служит подвижная граница. На этом этапе начинается разделение макромолекул по заряду: молекулы будут располагаться в геле последовательно между ведущими и замыкающими ионами в соответствии со своей подвижностью, определяемой зарядом. Когда зона белка достигнет границы между концентрирующим и разделяющим гелем, она столкнется с меньшим размером пор и другим значением pН. Величину pН разделяющего геля подбирают таким образом, чтобы увеличить степень диссоциации, а следовательно, и подвижность замыкающих ионов. Замыкающие ионы обгоняют макро- молекулы и движутся за ведущими ионами, а макромолекулы теперь движутся в поле с постоянной напряженностью. Стартовый и концентрирующий гели имеют сравнительно крупные поры, уменьшающие диффузию, но не снижающие скорость движения макромолекул под действием электрического поля. Разделяющий гель более мелкопорист, что замедляет движение макромолекул соответственно их молекулярной массе и улучшает разделение, обусловленное различной электрофоретической подвижностью этих молекул.

Задача 17. При исследовании электрофоретической подвижности белков лізоцим прошел в геле путь, равный 2.5 см, бычий сывороточный альбумин - 1.8 см, а фибриноген - 1.1 см. Мол. масса лизоцима и фибриногена - 14.1 и 330 кДа соответственно. Рассчитайте мол. массу сывороточного альбумина.


Загрузка...
Яндекс.Метрика Google+