Тонкослойная хроматография принципиально ничем не отличается от бумажной, но позволяет использовать большое разнообразие материалов для неподвижной фазы. Частицы неподвижной фазы могут быть менее 0.1 мм, потому соотношение поверхность/объем очень велико (большая активная поверхность). Активная поверхность в колоночной хроматографии намного меньше, чем в тонкослойной хроматографии, так как слишком мелкие частицы спрессовываются под действием силы тяжести в колонке, что приводит к уменьшению скорости движения жидкости, а это крайне нежелательно из-за размывания зон за счет диффузии при очень малой скорости потока. При этом пятна в тонкослойной хроматографи получаются меньше, чем в бумажной хроматографии, и, следовательно, возрастают разрешающая способность и чувствительность (для тонкослойной хроматографи требуется в 50-100 раз меньше вещества для разделения, чем для бумажной: для аминокислот - в 10 раз меньше, для нуклеотидов - в 100 раз меньше). С помощью тонкослойной хроматографии можно обнаружить вещество в количестве до 1н моля.

К абсорбционной хроматографии относятся ионообменная и аффинная хроматография. Принцип ионообменной хроматографии состоит в том, что заряженные молекулы за счет электростатического взаимодействия обратимо адсорбируются твердой неподвижной фазой, несущей заряженные группы и называемой ионообменником. Разделение на ионообменниках обычно проводится в две стадии: сперва соединение, которое требуется отделять, связывается с ионообменником в условиях образования стабильной связи, затем ионообменник промывают буфером с другим значеним pН или с другой ионной силой, в результате чего компоненты буфера конкурируют со связанным веществом за связывающие центры и вызывают его вымывание из ионообменника. Ионообменную хроматографию часто используют для разделения белков, полисахаридов, нуклеотидов, аминокислот и других биологически важных небольших молекул. Но наиболее специфическим "биологическим" методом хроматографии является аффинная хроматография, которая использует относительно слабое обратимое взаимодействие (биологическое сродство) между выделяемым веществом и специфически связывающейся с ним молекулой (лигандом). Такие силы действуют, например, между ферментом и его субстратом или ингибитором, антигеном и антителом, гормоном и рецептором и т.д. Для осуществления фракционирования по биологическому сродству, т.е. методом аффинной хроматографии, один из "партнеров" такой пары ковалентно "пришивается" к частицам неподвижной фазы, а сорбцией и вымыванием второго "партнера" управляют путем изменения условий биологического взаимодействия в результате введения в промывающий раствор солей, мочевины, детергентов, конкурирующих за связывание молекул или путем изменения его pН.

Задача 16. При проведении гель-проникающей хроматографии объем растворителя, требуемый для вымывания из колонки высокомолекулярного полисахарида голубого декстрана, который не проникает внутрь геля, составил 78 мл, а объемы растворителя для вымывания белков фибриногена, каталазы и яичного альбумина составили 86, 118 и 172 мл соответственно. Используя данные таблицы 5, оцените M и rгидр для фермента каталазы.


Загрузка...
Яндекс.Метрика Google+