Принцип хроматографии состоит в том, что вещества помещают в систему, которая содержит два физически различных компонента - подвижную и неподвижную фазы, и в которой разделение по типам молекул происходит за счет различий (часто весьма незначительных) в распределении между этими двумя фазами. Относительная подвижность каждой молекулы зависит от соотношения между движущей силой (движение подвижной фазы) и силами удерживания (распределение и адсорбция). Когда эффекты адсорбции невелики, то говорят о распределительной хроматографии, а когда адсорбция является главным процессом, приводящим к разделению веществ, то об адсорбционной хроматографии.

К распределительной хроматографии относятся колоночная хроматография, хроматография на бумаге и тонкослойная. Колонкой служит трубка, заполняемая неподвижной фазой и растворителем. Когда неподвижная фаза состоит из мелких частиц инертного материала, который содержит маленькие поры, хроматография называется гель- проникающей или молекулярно-ситовой хроматографией. Если раствор, содержащий молекулы различной величины, пропускать через такую неподвижную фазу, то молекулы, размер которых превышает размер пор, будут двигаться только в пространстве между частицами и поэтому не будут задерживаться неподвижной фазой. Однако молекулы, размеры которых меньше размера пор, диффундируют в частицы и обратно, причем вероятность этого повышается с уменьшением их размера, т.е. их движение вдоль неподвижной фазы замедляется (рис. 27). Если материал частиц в неподвижной фазе (гель) не адсорбирует движущиеся с раствором молекулы, то вероятность проникновения молекул в поры является основным фактором, определяющим скорость их движения вдоль неподвижной фазы. Следовательно, молекулы вымываются из неподвижной фазы в порядке уменьшения их размера или, если форма их относительно похожа (например, глобулярная или линейная), то в порядке уменьшения молекулярной массы. Для различных типов гелей установлено, что зависимость параметра К = (Ve-Vo)/Vs от lgM практически линейна для всех молекул, исключая очень большие и очень маленькие.

Здесь Ve - объем растворителя, требуемый для вымывания интересующего соединения, Vo - "холостой" объем, необходимый для вымывания соединения, которое не проникает в неподвижную фазу, Vs - объем неподвижной фазы и M - молекулярная масса. Таким образом, для определения M достаточно пропустить через неподвижную фазу несколько типов молекул с известной молекулярной массой, по полученным данным построить прямую линию, после чего M образца можно определить интерполяцией. Такой хроматографический метод используется для глобулярных белков и многих углеводов, позволяя определять их M с точностью около 10%. Однако более тщательный теоретический анализ приводит к линейной зависимости К от lgrгидр, где rгидр - эффективный радиус гидратированной молекулы. Это та самая величина, которая получалась бы из диффузионных измерений, если бы мы, никак не учитывая форму молекулы, просто формально применили бы закон Стокса: kT/D = f = 6phrгидр. Линейная зависимость К от lgrгидр лучше согласуется с экспериментальными данными, чем зависимость К от lgM. Результаты, полученные с помощью гель- проникающей хроматографии, можно скомбинировать с измерениями коэффициента седиментации, что позволяет точнее определять молекулярную массу. Как метод гель-проникающая хроматография полезна также при изучении систем взаимодействующих молекул.

Однако основное применение гель-проникающей хроматографи - разделение веществ. Она находит широкое применение для очистки белков, в частности ферментов, и нуклеиновых кислот.

В случае хроматографии на бумаге неподвижной фазой служит целлюлоза в виде листов бумаги. Движение растворителя по бумаге обеспечивают капиллярные силы. С растворителем двигаются и растворенные вещества, каждое со своей скоростью, определяемой природой вещества, сортом бумаги и природой растворителя. Как только фронт растворителя приблизится к противоположному концу бумаги, его высушивают.

Разделенные вещества располагаются пятнами и различаются по их относительному расположению на бумаге. Хроматография на бумаге позволяет осуществлять двумерную хроматографию: после проведения хроматографии в одном направлении бум агу высушивают и затем повторно хроматографируют под прямым углом к направлению первоначального движения растворителя с использованием другого растворителя. При этом часто происходит разделение веществ, которые не разделяются в первом растворителе.

Важным применением хроматографии на бумаге в исследовании белков является метод пептидных карт. Если белок подвергать расщеплению в стандартных условиях с использованием набора различных специфических протеиназ (ферменты, разрывающие пептидные связи только после определенной аминокислоты или класса аминокислот), в качестве продуктов образуются небольшие пептиды. Пептиды можно затем разделить с помощью двумерной хроматографии на бумаге, получая при этом распределение пятен, которое практически никогда не совпадает для различных белков. Такая пептидная карта называется "отпечатками пальцев" (fingerprinting) (рис. 28). Метод пептидных карт можно использовать для идентификации выделенного белка, для установления изменений аминокислотного состава в мутантном белке (если замена аминокислоты не влияет на место разрыва связи протеиназой, на пептидной карте будет исчезать одно пятно, вместо котрого будет появляться другое; если замена приводит к изменению места разрыва связи, изменят свое положение сразу несколько пятен) или для доказательство того, что белок А является продуктом расщепления большего белка Б или получается в результате преждевременного обрыва цепи аминокислотной последовательности (если на пептидной карте белка А имеются все те же пятна, что и на пептидной карте белка Б, весьма вероятно, что белок А является частью аминокислотной последовательности белка Б).


Загрузка...
Яндекс.Метрика Google+