Материал для биохимических исследований. Обычно биохимические исследования проводят на специально подобранной материале, который получают от животных, растений, бактерий и вирусов. Это могут быть целые организмы, продукты их жизнедеятельности (гумус, молоко, моча), органы, ткани, отдельные клетки, части клеток. Материал, полученный для биохимических исследований, называют пробами. Пробы берут как можно быстрее по специально разработанным методикам и сразу же фиксируют с помощью специальных веществ. Затем к анализу хранят в холодильных камерах при температуре от 0 до -4 ° С. В случае, если исследуемое вещество не подлежит консервации (например белки), а необходимо длительное хранение, то пробы в пробирках закладывают в специальные морозильные установки или погружают в жидкий азот, где их держат за температуры от -30 ° С и ниже . Все эти меры средства не ¬ обходные, чтобы обеспечить максимальное сохранение того химического состава, который был при жизни.

 

Одним из надежных фиксаторов является этиловый спирт. (Из курса химии вспомните его формулу, свойства.) Именно спирт используют для длительного хранения проб и последующего исследования структуры ДНК.

 

Выделение необходимых веществ. Важнейшей биохимической процедурой является выделение необходимой для анализа вещества. Этот процесс очень кропотливый, поскольку в любой клетке, ткани или органе одновременно содержатся сотни и тысячи различных соединений. Во многом развитие биохимических исследований связано именно с разработкой методик выделения из биологических объектов веществ и их очистки. Для того чтобы процесс выделения был эффективным, используют те виды организмов или части тела, в которых концентрация исследуемого вещества максимальна. (Вспомните, откуда впервые была выделена сахароза, а откуда - глюкоза и фруктоза.) Выделение определенных веществ основывается на особенностях их физических или химических свойств - различия в молекулярной массе, формах, размерах и зарядах молекул, растворимости в воде и других растворителях, специфические реакции с определенными веществами и др.. Наиболее распространенными методами разделения смесей веществ, которые используют в биохимии, является выпаривание, фильтрация, диализ (от греч. Диализис - разложение, отделение), который основан на способности веществ диффундировать через специальную полупроницаемую мембрану, перегонка - выпаривания жидкости при заданной температуре с последующей конденсацией, экстракция и кристаллизация. (Вспомните, как ведут себя насыщенные растворы солей.)

 

Методы исследования в биохимии. Основная задача, которая стоит перед биохимиками, - определение присутствия конкретного вещества в пробе и оценка ее количества. В случае, если обнаруженное вещество ранее не была известна науке, то устанавливают ее формулу, пространственную структуру, химические и физические свойства, функции в организме. Для того чтобы решить эти задачи, ученые располагают арсенал приемов, которые представляют собой совокупность специально разработанных методов и методик.

 

Объемно-весовой анализ основан на количественном определении объема или массы выделенных веществ. Если анализируют жидкое вещество или раствор солей, то количественная оценка вещества производится путем титрования (от фр. Титр - характеристика). Например, в щелочной раствор сначала добавляют индикатор фенолфталеин до появления малиновой окраски, а затем специальными пипетками - каплями кислоту. В момент нейтрализации, когда исчезает окраска, фиксируют количество затраченного кислоты, что и является количественным показателем анализируемого вещества.

 

Количественное определение сухого вещества проводится путем взвешивания, для этого могут использоваться веса с разным уровнем разрешения от 1 г. до 1 мг. Например, перед исследователем поставлена задача: определить массу нерастворимой в воде вещества, содержащиеся в пробе молока. Для этого молоко фильтруют, полученный осадок промывают, жидкость выпаривают, а полученное вещество сушат и прокаливают до постоянной массы. Затем сухое вещество взвешивают.

 

Оптические методы. Это наиболее чувствительные из биохимических методов, которые позволяют определить содержание вещества в пробе в концентрации менее тысячной мг. Кроме того, эти методы имеют высокую специфичность и точность. Оптические методы основаны на свойствах химических соединений окрашивать раствор и таким образом делать его непрозрачным. В результате в зависимости от концентрации красителя изменяется интенсивность поглощения световой энергии, фиксируется специальными приборами. Различают несколько групп оптических методов.

 

Спектральный анализ позволяет определить состав молекул и атомов в пробах на основании определения спектров поглощения и излучения световой энергии. Обычно с помощью этого метода в пробах определяют состав химических элементов.

 

Люминесцентный анализ имеет особенно высокую чувствительность. Он основан на явлении люминесценции - свечении вещества, возникающее после поглощения ею энергии возбуждения. На исследуемый биологический объект действуют ультрафиолетовым светом и по цвету люминесценции определяют присутствие определенного вещества.

 

 

Другие методы. Хроматография (от греч. Хрома - цвет и графия - письмо) - метод разделения и анализа смесей веществ, основанный на распределении их компонентов между двумя фазами - не подвижной, выполняющий роль сита, которое с разной скоростью пропускает молекулы в зависимости от их физических и химических свойств, и подвижной, протекающей через неподвижную. В результате смеси вещества делятся на группы - фракции, например на простые и сложные белки.

 

Электрофорез (от лат. Электро и греч. Форез - переносить). Поскольку макромолекулы различаются между собой зарядом, то в электрическом поле они движутся с разной скоростью. Если, например, подготовленную пробу крови поместить на специальную бумагу, пропитанную солевым раствором - буфером, который имеет постоянное значение рН, а затем в одной стороны бумаги подвести анод, а в другой - катод, то белки крови с разной скоростью начнут мигрировать от катода к анода. Если через некоторое время ток отключения, а бумага покрасить специальным красителем, то можно обнаружить группы белков, различающихся зарядом, которые соответственно имеют разную электрофоретической подвижностью. В современной биохимии для электрофореза применяют специальные гели - желеподобным вещества, имеющие микропоры, через какие белки, движущихся в электрическом поле, или молекулы нуклеиновых кислот будто фильтруются.

 

В биохимии белков и нуклеиновых кислот незаменимым является метод ультрацентрифугирования. Метод основан на том, что отдельные части молекулы ДНК отличаются по размерам и массе, а потому будут с разной скоростью оседать в растворе под воздействием центробежной силы. Причем большие по размерам молекулы располагаться на периферии, а с меньшим удельным весом - ближе к оси вращения. Ультрацентрифугирования проводится в специальных центрифугах, осуществляющих до 50 тыс. оборотов в минуту. В результате во время длительного центрифугирования проб, помещенных в очень прочные пробирки, удается не просто разделить фракции ДНК, но и выделить их в достаточном количестве.

 

Очень популярным в биохимии является метод радиоактивного мечения. Для этого используются радиоактивные изотопы (от греч. Изос - одинаковый и топос - место). (Вам уже известно, что изотопы - это атомы одного химического элемента, отличающихся числом нейтронов.) Один из основных элементов живого Карбон существует в природе в виде нескольких изотопов. Если в стакан с водой, где содержатся одноклеточные водоросли, добавить немного угольной кислоты с 14С, а потом поставить ее на солнце, то через некоторое время благодаря фотосинтезу часть СО2, образующегося при разложении этой кислоты, окажется включенной в состав клетки. Профильтровав содержимое стакана и проведя измерение радиоактивности фильтра, в котором оказались водоросли, можно определить скорость накопления углерода, что и будет соответствовать интенсивности фотосинтеза и метаболизма водорослей. Рассматриваемый метод исследования получил название радиоуглеродной анализа. Подобные исследования можно проводить и с животными, и даже с отдельными клетками.

 

Математический анализ данных. Полученные результаты измерений называют первичными данными. Их сначала заносятся в лабораторный журнал, а потом формируют электронную базу данных и подвергают математической обработке, которая позволяет определить надежность и достоверность полученных результатов с помощью алгоритмов. При этом обычно вычисляется среднее значение, например, содержания жиров в молоке, полученное в серии опытов, и статистическая ошибка этого среднего значения. Если ошибка незначительна, то можно утверждать, что полученные результаты достоверны, а не является следствием случайных совпадений. С помощью алгоритмов биометрии (вспомните, что это за наука) можно проводить и более сложные расчеты - определять вероятность тенденций или скорости изменения различных процессов. Для этого проводится моделирование с последующим сопоставлением полученной модели с реально существующим объектом или процессом, что позволяет с той или иной степенью вероятности утверждать вероятность различий в результатах наблюдаемых и ожидаемых процессов, происходящих в организме.

 

Результаты обобщаются в виде таблиц, графиков и диаграмм - специальных графических изображений, наглядно числовые соотношения. Для этого используют соответствующие компьютерные программы.

 

Вывод. Современная биохимия - это наука, развитие которой тесно связано с разработкой методов выявления, количественного анализа и выделение различных веществ, содержащихся в организме или образуются в результате жизнедеятельности. В создании этих методов используются не только достижения химии и физики, но и математические алгоритмы и информационные технологии.


Загрузка...
Яндекс.Метрика Google+