Рассредоточение полезных организмов в агроценозах. Методики их выявления и учет численности

Сейчас, с теоретическим развитием и внедрением в практику идей и принципов интегрированной защиты растений, значительное внимание уделяется естественным биотические регуляторам численности вредных видов фитофагов. Общеизвестно, что любой фитофаг в естественных условиях связан с более или менее широким комплексом организмов. В ряде случаев этот комплекс снижает численность фитофаг к минимуму и потребность в любых истребительных мероприятиях отпадает. В связи с этим в практике защиты растений очень важно учитывать роль биотических факторов в регулировании численности вредителей. Для многих видов вредных насекомых определены уровни эффективности энтомофагов, при которых истребительные мероприятия нецелесообразны (табл. 22).

 

Для выявления инфекционных заболеваний с учетов при сборе насекомых обращают внимание на симптомы болезней. Характер проявления заболеваний инфекционной природы может быть различным. Он определяется прежде всего свойствами возбудителя, видовыми и возрастными особенностями хозяина, его физиологическим состоянием, а также сопутствующей микрофлорой, качеством и количеством корма и влиянием внешних условий, прежде всего - температуры и влажности.

 

У больных особей первую очередь могут существенно меняться поведин-тельно реакции. У многих видов членистоногих-фитофагов при инфекционных заболеваниях нарушается характерна координация движений, изменяются свойственные им инстинкты. В частности, ряд видов совок при таких вирусных заболеваниях, как ядерного полиэдроза и гранулезы миирують в верхнюю часть растений, что для здоровых насекомых нехарактерно.

 

Саранчовые при заболевании ентомофторозы сосредотачиваются на верхушках растений и там погибают. Похожее явление можно наблюдать и в случае поражения гусениц совки-гаммы и других видов совок грибом Tarichium megospenmm. При инфекционных болезнях насекомые отстают в росте, частично или полностью прекращают питания.

 

Внешний вид фитофагов может существенно меняться. Конечно многие возбудителей инфекционных болезней развиваются в клетках жирового тела. При этом в клетках накапливается масса микроорганизмов и жировое тело теряет прозрачность, приобретая характерный мраморного оттенка. В итоге на личинках насекомых появляются различные по величине белые пятна. В острый период течения заболевания пятна могут распространяться на большей части тела.

 

У больных и погибших особей развиваются сапрофитные микроорганизмы, что приводит к потемнению тела и его быстрого разложения.

 

Распространенные в популяциях чешуекрылых насекомых-фитофагов болезни, вызываемые бакуловирусамы. Пе - ядерного полиэдроза и гранулезы. Внешние признаки болезней во многом схожи независимо от вида хозяина. Характерные особенности присущи кишечной форме ядерного полиэдроза, при которой поражается эпителий среднего отдела кишечника личинок и развивается диарея. Больные и погибшие особи фиксируются к субстратам клейкими выделениями из ротового и анального отверстий.

 

Заболевания, вызываемые бактериями, часто объединяют общим названием - септицемия или фляшерия. При этой болезни возбудитель проникает в гемоциль и размножается в гемолимфе. Внешними признаками являются: прекращение питания, вялость и недвижимость, из анального отверстия следует темный ескудат более или менее жидкой консистенции неприятного запаха; потемнение гемолимфы, разрушение кишечника и мышц, изменение окраски наружных покровов, размягчения тела. Трупы приобретают неприятный гнилостного запаха. Наружные покровы легко разрываются.

 

Менее разнообразные внешние проявления заболеваний, вызываемые фибамы. При ентомофторозив больные особи обычно скапливаются на верхних частях растений, мумифицируются и фиксируются к субстрату ризоидами гриба.

 

Мускардиноз, аспергиллез и цефалоспориоз сопровождаются обильным грибным налетом белого, зеленого или черного цвета. Для красной мускардина характерно отсутствие налета на поверхности тела больных и погибших особей. Внутренние органы трупов превращаются в порошок кирпично-красного цвета, что облегчает диагностику болезни. При оценке роли энтомопатогенных микроорганизмов в регулировании численности фитофагов за обследование сельскохозяйственных угодий из проб насекомых или других членистоногих-фитофагов отбирают особей с четко выраженными признаками заболевания и оценивают степень зараженности в процентах к общему их количеству в пробе. Для исследования берут по несколько особей одного вида из различной степени проявлением заболевания. Затем с каждой особи на предметном стекле делают мазки гемолимфы, жирового тела и содержимого кишечника. Если животные мелкие, такие как галловая или цистообразующей нематоды, клещи-фитофаги, тли, личинки младших возрастов т.д., возможны мазки из вмистимого тела. Одновременно больных насекомых фиксируют в любой фиксирующей жидкости.

 

Биоматериал, собранный в полевых условиях, исследуют в лаборатории. Микроскопия нативных и окрашенных материалов позволяет выявить все основные группы микроорганизмов. При этом применяют методы обычной люминесцентной и электронной микроскопии.

 

При обычной световой микроскопии особенности приготовления нативных препаратов для идентификации инклюзийних вирусов зависят от типа заболевания. При выявлении ядерного полиэдроза, гранул и ромбических включений ентомопоксвирусив исследуют жировое тело, поражается прежде. Для этого личинку препарируют и вырезают из различных участков тела небольшие кусочки жировой ткани, кладут их в каплю глицерина с физиологическим раствором и накрывают небольшим покровным стеклом, на него кладут большое покровное стекло, края которого заливают парафином или клеем. Приготовленный таким образом препарат можно хранить на холоде несколько месяцев.

 

По ядерного полиэдроза в жировом теле выявляют методом фазового контраста очень гипертрофированные клетки ядра, содержащие массу овальных, преломляющих свет, включений (рис. 3).

 

В нативных препаратах жирового тела за гранулезы можно обнаружить гипертрофию и дезинтеграцию ядра (рис. 11). Отдельные гранулы заметно лишь в фазовом контрасте или при максимальном увеличении микроскопа с использованием метода темного поля.

 

Ромбические включения ентомопоксвирусив обнаруживают в цитоплазме жировых клеток с просмотра препаратов в фазовом контрасте (рис. 12).

 

Препараты для выявления полиэдроза перепончатокрылых и цитоплазматических полиэдроза чешуекрылых готовят из среднего отдела кишечника. Препарированную кишечную трубку разрезают вдоль по всей длине, расправляют на предметном стекле в капле глицерина с физиологическим раствором и накрывают покровным стеклом. Изготовлены временные нативные препараты исследуют под микроскопом. В фазовом контрасте в эпителии средней кишки ложных гусениц, больных ядерного полиэдроза, небольшого увеличения (объектив X] 0) обнаруживают характерную крапчатость, обусловленную гипертрофированными ядрами. При значительных увеличениях (ФК объектив водной иммерсии X 70) заметны полиедренни тельца.

 

Идентификация вирусов цитоплазматического полиэдроза облегчается их локализацией в цитоплазме цилиндрических и бокалоподибних клеток эпителия среднего кишечника.

 

Анализы личинок в острой фазе заболевания позволяют уверенно идентифицировать Бакула-и реовирусы в связи с их тканевым тропизмом.

 

При анализе сухого патологического материала кусочки из средней части трупа растирают в небольшом количестве воды и готовят взвеси, которые исследуют в раздавленной капли или готовят мазки для последующей окраски

 

Трудоемкая анализы яиц насекомых. Препараты для микроскопических исследований готовят одним из следующих способов. Самый простой - раздавливания яиц непосредственно на предметном стекле и приготовления раздавленной капли мазков. Однако в связи с тем, что вирусных включений в яйцах немного, их концентрируют. Для этого с определенной навески яиц готовят гомогенат в 10-кратном объеме воды, фильтруют через 2-3 слоя марли и центрифугируют до полного освещения жидкости. Осадок ресуспендують и снова центрифугируют. Операцию повторяют 3-4 раза. С центрифугату готовят мазки для последующей окраски.

 

Препараты, производимые методом раздавленной капли, а также неокрашенные мазки осматривают в фазовом контрасте или методом темного поля. Эффект положительного и отрицательного контраста дает одинаково четкие результаты.

 

В темном поле ядерные и цитоплазматические полиэдры имеют вид ярко освещенных капель воды на незмочуваний поверхности. В препаратах, содержащих значительное количество посторонних примесей, их обнаруживают по форме и интенсивным преломлением света.

 

Гранулы в темном поле выглядят точками, светящиеся. Гранул размером 0,5 x1, 5 мкм даже на окрашенных препаратах невозможно обнаружить под обычным микроскопом, а в темном поле их хорошо заметно.

 

Вирусные включения можно спутать с некоторыми продуктами клеточного и тканевого метаболизма за анализа сухого патологического материала, а также тканевой детрит методом раздавливания капли. У насекомых в фазах передлялечкы и куколки обнаруживают массу протеиновых телец, которые морфологически похожи на полиедренних включений вирусного происхождения. Эти образования есть и в кишечнике взрослых насекомых. При анализе такого материала прибегают к специальным методам Окраска. В мазках могут содержаться кристаллы мочевой кислоты и различных уратов. Среди других образований, что затрудняют диагностику вирусных болезней насекомых, следует обратить внимание на ромбические кристаллы меланина, иногда формируются в большом количестве в цитоплазме некоторых клеток.

 

Вирусные включения, характерные для Бакула-и поксвирусив, не окрашиваются обычными гистологическими красителями. Для их выявления обычно практикуют предварительную обработку препаратов слабыми растворами щелочей. После действия 1%-ного щелочи ядерные полиэдры интенсивно воспринимают многие гистологических красителей: гематоксилин, эозин, фуксин, генцианвиолет, метиленовую синьку т.д.. На этом свойстве телец-включений основывается большинство методов их обнаружения. При этом одним из самых простых и эффективных является метод Швецовой. Высушенный на воздухе препарат фиксируют смесью спирта с формалином (90 мл 70%-ного спирта и 10 мл 40%-ного формалина) в течение 1-20 мин. После фиксации мазок просушивают фильтровальной бумагой и обрабатывают в течение 1 мин 1%-ным раствором едкого натрия. Затем препарат окрашивают 5%-ным водным раствором эозина С-5 мин. При этом полиэдры окрашиваются в розовый цвет, а общий фон препарата остается светлым.

 

При идентификации вирусов, вызывающих кишечные полиэдроза в трачу, учитывают некоторые анатомические особенности насекомых-хозяев. В коконованих фаз и имаго трачу в полости тела возможно наличие темных плотных образований, так называемых цист или гисевдопух-лин. Чаще всего такие образования бывают у насекомых, переживших вирусное заболевание. их обнаруживают при непосредственном анатомирования насекомых, а также с помощью просвечивания имаго, предварительно просветленных кипячением в едком калии. Псевдоопухоли обычно состоят из компактных масс эпителиальных тканей кишечника, не подвергавшихся гистолиз. В них можно обнаружить бактерий и вирусов.

 

Цитоплазматических полиэдров окрашивают насыщенным водным раствором в метиленовой сини и по Романовскому-Гимза без предварительной обработки щелочами и кислотами. Мазки фиксируют на пламени и окрашивают в течение часа. Свойство цитополиедрив окрашиваться без обработки щелочами и кислотами используют для диф-ренцийнои диагностики их от ядерных полиэдров. Однако следует помнить, что свойства вирусных включений с возрастом меняются, а сами они теряют способность окрашиваться.

 

Ромбоидальни кристаллы, характерные для ентомопоксвирусив, в начальный период формирования, когда по размеру не превышают 0,7-1 мкм, окрашиваются анилиновыми красителями. Созревшие вирусные включения становятся устойчивыми к окраску, а потому их следует предварительно обрабатывать соляной кислотой или щелочью. Процесс окраски спелых включений такой: препарат выдерживают в течение нескольких секунд при 100 ° С, затем 3-1 мин обрабатывают соляной кислотой или щелочью (1%-на ОН или 2% Нее) и окрашивают по Романовскому-Гимза. Наилучшие результаты при окраске гранул дает метод Швец-вой. При этом фиксируют мазок смесью спирта и формалина в течение 10 мин. После удаления фиксатора препарат обрабатывают 1 мин 1%-ным лугом, промывают, высушивают и окрашивают карболовым фуксином в течение 1 мин. После окраски препарат тщательно промывают. По этому способу мелкие формы бактерий окрашивают, как и гранулы. Для дифференцирования вируса параллельно окрашивают другой препарат, но без обработки щелочью. При этом гранулы не воспринимают красителя и не заметны под микроскопом.

 

Для установления тканевой и клеточной локализации патогенов готовят срезы насекомых обычными гистологическими методами.

 

Риккетсии плохо окрашиваются анилиновыми красителями. Обычно их окрашивают азур-зозином по Романовскому-Гимза, или раствором Макиавелли. Практикуют также метод Кастенди, по которому препарат обрабатывают 3 мин в 1%-ной метилового синие, растворенной в фосфатном буфере с pH 7,5, затем подкрашивают в 10 мл 1%-ного сафранину с 30 мл 0,1%-ной уксусной кислоты .

 

Бациллы, в частности такой важный патоген как Bacillus thuringiensis, окрашиваются по-разному. Париспоральни включения или эндотоксины. легко окрашивают по Романовскому-Гимза выщелоченные фуксином и кристалвиолетом. Простой способ комплексного окраски предложенный А.Б. Гукасяном. Суть его в том, что 1,5 г анилинового красителя для шерсти (черного, синего или зеленого) растворяют в 50 частях 98%-ного этанола, затем добавляют 40 частей дистиллированной воды и 10 частей кислоты. Краситель наносят на фиксированные высокой температурой мазки, пока предметное стекло е не остыло. После промывания мазки докрашивают 30%-ным водным раствором карболовой фуксина Циля.

 

Параспоральни включения Bacllus popilliae выявляют с помощью окраски по Цель-Нильсоном. Этот метод, а также методы окраски по Граму жгутиков, бактериальных спор, выявления капсул и включений в микроорганизмов изложены в практических рекомендациях.

 

Для микроскопического изучения грибов используют специальные приспособления: камеры Ранвье, кольца Ван Тигема и другие. По методу Н.М. Пидопличко грибы можно культивировать непосредственно под покровным стеклом в капле агаризованной питательной среды.

 

Для окраски грибов без нарушения их жизнеспособности применяют метиловый синий, генцианвиолет, нейтральрот, хлопчатниковый синий и другие красители.

 

В некоторых случаях для выявления различных микроорганизмов эффективным оказывается метод приведенной люминесценсии. Готовят препарат для люминесцентно-микроскопического анализа следующим образом. Мазки фиксируют на пламени. После этого препарат недолго обрабатывают эфиром для удаления жировых веществ. Обработка эфиром не сказывается на результатах анализа и позволяет избавиться определенной части посторонних примесей. Необходимым моментом в подготовке мазка до флуо-рохромування является протравливание его 5%-ным раствором карболовой кислоты в течение 10 минут. Карболовой кислоты, оставшейся после этого на препарате, смывают дистиллированной водой, а остатки удаляют с помощью фильтровальной бумаги.

 

Флуорохромування осуществляют с помощью акеридинового оранжевого в концентрации 1:40000 течение 15 минут. Раствор флуо-рохрому готовят из основного 1%-ного раствора с разбавлением его до необходимой концентрации фосфатным буфером с pH 5. Препарат промывают водой и после высушивания осматривают в падающем сине-фиолетовом свете (фильтры 2ФС-1 и 2СЗС-7) с объективом масляной иммерсии. При этом вирусные включения люминесцирует желто-зеленым (I-1), бактерии - хромово-оранжевым (0-3), а тканевые остатки - коричневым (В-7) различной интенсивности.

 

Полиэдры из свежего патологического материала могут люминесциюваты хромово-оранжевым, поскольку интенсивно воспринимают красителя, чем тельца-включения, хранившиеся определенное время. В таком случае следует сократить время флуорохромування или дифференцировать закрашенный препарат 2%-группой соляной кислотой с последующим промыванием его водопроводной водой.

 

Метод позволяет выявлять полиэдры при смешанных заболеваний насекомых при анализе загнившие или сухого материала, когда в препаратах содержится огромное количество сапрофитных микроорганизмов.

 

Флуорохромування позволяет достаточно четко дифференцировать в мазках вегетативные клетки, споры и кристаллы эндотоксины Bacillus thuringiensis. Готовят препараты для микроскопии так. Мазок культуры на предметном стекле после высушивания фиксируют 5 минут 5%-ной карболовой кислотой. После промывания водой препарат флуо-рохромують акридиновым оранжевым течение 5 минут. Раствор красителя готовят на фосфатном буфере с pH 5,3 в концентрации 1:50000. В горящих сине-фиолетовых лучах люминесцентного микроскопа при этом наблюдается ярко-красное свечение вегетативных бактериальных клеток, светло-желтый - кристаллов токсина и зеленый - спор.

 

Для целенаправленного поиска определенных видов патогенов применяют иммунофлуоресцентного микроскопию препаратов.


Загрузка...
Яндекс.Метрика Google+