Грибные препараты

 

Грибы как продуценты препаратов для подавления численности вредных организмов отличаются от других патогенных микроорганизмов путями проникновения в организм хозяина, механизмами патогенного действия и спектрами активности, то есть - специфичностью. Среди них есть виды как узкого спектра действия, например, ентомофторови грибы, так и очень широкого, например Trichoderma iignorum - гриб-антагонист многих фитопатогенных организмов, или Beauveria bassiana, что может поражать более 200 видов насекомых.

 

Грибы различаются между собой по потребностям в питательных веществах и условиях для роста и развития. Если одни из них едва удается культивировать, то остальные можно легко выращивать на различных питательных средах. Все грибы отличаются от бактерий тем, что они значительно медленнее растут и развиваются. Кроме того, в мицелия грибов и их спор меньше жизнеспособность, чем определяются и меньшие сроки хранения грибных препаратов. Грибы проявляют патогенность, как правило, в стадии спор, для формирования которых необходимы определенные условия. Благоприятные условия для этого складываются за поверхностного культивирования. Однако этот способ малопродуктивный и не дает возможности получать достаточного количества препаратов в условиях традиционного микробиологического производства. Решением проблемы может стать разработка глубинного выращивания грибов. Однако, пока эти работы еще далеки до завершения, поскольку на патогенность грибов, так же, как и других микроорганизмов, в решающей степени влияет режим культивирования, а именно - состав питательных сред, условия аэрации, которые определяют, учитывая видовые и штаммов особенности микроорганизмов . Кроме того, в связи с характерным для грибов медленным ростом процессы ферментации отнимают много времени. Например, выращивание ентомофторових грибов продолжается 10 и более суток, а грибы рода Ascheresonia начинают обильно спороноситы лишь на 30-й день после начала культивирования. Между от продолжительности технологического цикла напрямую зависит стоимость препаратов.

 

С фибних препаратов для защиты растений применяют боверин, биомассу фибив рода Ascheresonia, биомассу Verticillium lecanii, различных видов хищных гифомицетив, триходермин и некоторые другие. Технология производства грибных препаратов в значительной степени отработана на примере боверин.

 

Боверин изготавливают на основе энтомопатогенных гриба Beauveria bassiana (Bals.) Vuill - одного из наиболее изученных видов. Культуры В. bassiana сравнительно хорошо сохраняются в пробирках на сусло-агаре или на пшене в холодильнике. Пересевают их на свежие среды через 2-6 месяцев. Гриба культивируют на питательных средах различного состава. Для производства препарата предложено много компонентов питательных сред и несколько способов культивирования, принципиально объединяются в три: поверхностный, глубинно поверхностный и глубинный.

 

При поверхностном способе суспензию спор наносят, разбрызгивая на поверхность субстрата, которым могут быть сусло-агар, стерильные картошки, моркови, сахарной свеклы, кожура арбуза, черешки листьев, зерна кукурузы или других злаков, мукомольные отходы. Поверхностное культивирование практикуют также на жидких средах (сусло, отвары картофеля и т.д., среды с кукурузным дрожжевым экстрактом, патокой), которые наливают слоем 0,7-1,0 см в плоские противни и накрывают стеклом. Вносят посевной материал в жидкие среды не обязательно разбрызгиванием. За добавление в среду антибиотиков с фунгицидной активностью, а также за внесение большого количества посевного материала гриба можно выращивать на нестерилизованных средах или частично стерилизованных. Культивирование осуществляют при температуре 25-28 ° С и повышенной влажности воздуха. Через 2-3 дня после посева гриб образует сплошную мицелиальных пленку на поверхности сред. Спорообразования заканчивается в швидкоросту-чих штаммов на 6-8-й день выращивания. Тогда массу собирают.

 

Глубинно-поверхностный способ производства боверин предложено Институтом защиты растений УААН. Для посевного материала используют сусло и среду, содержащую кукурузный экстракт, патоку и минеральные соли. Последнее среда используется в ферментер. Посевной материал выращивают в колбах при температуре 25-26 ° С в течение 24-30 часов. Инокулюма для посевного материала является суспензия конидий из агаровой культуры или культура, выращенная на пшене. Используют посевной материал, содержащий 100-200 млн бластоспоры в 1 мл. Для ферментера емкостью 50 л берут 1-2 л посевного материала. Ферментируют по перемешивания и аэрации. При нормах расхода посевного материала - 1-2 млн пророщенных конидий на 1 мл среды в ферментер процесс глубинного выращивания длится 22-28 часов. Продолжительность ферментации уменьшается в случае оставления части культуральной жидкости в ферментер как посевного материала.

 

Следующей технологической стадией является продолжение выращивания гриба поверхностным способом в плоских кюветах, куда культу-ральной жидкости из ферментера наливают слоем 0,7-1,0 см. Выращивание в кюветах ведется при повышенной влажности и той же температуры. Через 16-18 часов при этом формируется грибная пленка на поверхности среды. Спорообразования заканчивается на 3-5-й день. Для приготовления препарата пленку измельчают, определяют титр спор и затем смешивают с каолином.

 

Глубинный способ выращивания В. bassiana самый, поскольку позволяет использовать традиционное ферментационное оборудование микробиологической промышленности и наладить крупнотоннажное производство боверин. Однако в условиях глубинной культуры гриб производит в основном бластоспоры, для которых характерна низкая инсектицидные активность и нестабильность при хранении. Специальный подбор сред для глубинного культивирования (оптимальное содержание амин-ного азота, полисахаридов, солей) позволяет получить глубинные конидии, что в течение 6 месяцев сохраняют биологическую активность на уровне конидий, образовавшиеся в условиях поверхностной культуры.

 

Боверин - это однородный порошок от белого до кремового цвета с титром не менее 2 млрд жизнеспособных спор на 1 г и содержанием влаги не более 5%, тонкости помола (остаток на сите с сеткой № 025 - не более 10% просеянной массы).

 

С применением глубинной культуры предложено регламенты производства нескольких инсектицидных грибных препаратов на основе таких грибов как Entomophtora traxteriana (ентомофторин), Ent. aphidis (микоафидин), Ent. pyriformis (пироформин), Metarhiiium anisopiae (метаризин), Hirsutella thompsoni (хирсутелин).

 

В Англии промышленным способом на основе глубинной ферментации производят два инсектицидных грибных препараты - микотал и верталек. Верталек создан для регулирования численности тлей в теплицах, а микотал - оранжерейной белокрылки. Оба препарата содержат споры гриба VerticiUium lecanii.

 

Производство эффективного препарата в условиях глубинной культуры стало возможным в результате специальных селекционных работ со штаммами гриба. Его получают в условиях производственных Биолаб-ратор полупромышленным путем методом поверхностного культивирования, используя для ограничения вредоносности вредителей в закрытом грунте биомассу нескольких видов зоогиатогенних грибов, в том числе виды из родов Arthrobotrys, Aschersonia, VerticiUium и некоторых других.

 

Хищные грибы рода Arthrobotrys широко распространены в почве, где паразитируют на мелких беспозвоночных. Получают биомассу гриба с помощью культивирования на различных органических субстратах. Один из способов - использование кукурузной сечки. При этом увлажненную сечку рассыпают в банках слоем в 2,5-3 см. Банки закрывают специальными крышками и стерилизуют в автоклаве при 1,5 атм в течение 40-50 минут.

 

Для приготовления посевного материала хищные грибы высевают в колбы емкостью 250 мл, на дно и стенки которых нанесен тонкий слой агаризованной среды. Через 7-15 дней вся поверхность колбы покрывается мицелием гриба, после чего начинается обильное сгюроно-ния, усиливающийся на рассеянном свете. Высыхая, пленка питательного агара прилипает к стенкам колбы. Тогда в колбу наливают 500 мл стерильной дистиллированной воды. Взбалтывая колбу, получают взвесь спор хищного гриба. Полученную споров суспензию набирают шприцем. Иглой, нагретой докрасна над пламенем водки, высевают культуру в культивационных банки, которые затем помещают в термостат с температурой 26 ° С. Через 12-14 дней, когда гриб разрастется и мицелий пронзит всю массу кукурузной сечки, банки выставляют на рассеянный свет для ускорения спорообразования. Через 3-5 дней биомассу вынимают, высушивают, измельчают и укладывают в тару для хранения.

 

Споры, полученные таким образом, сохраняют жизнеспособность не менее года.

 

Биомассу грибов рода Aschersonia получают на агаризованной пивном сусле с содержанием сахара 10-11%, агара - 2% с pH 5,5-6,5. Готовую среду разливают по 80-100 мл в 0,5-литровые молочные бутылки, закрывают ватно-марлевыми пробками и пергаментными колпачками и стерилизуют при 1 атм в течение 30 минут. После стерилизации бутылки кладут горизонтально для застывания среды и через сутки высевают споры гриба. Выращивают ашерсонию в светлых комнатах при температуре 25-26 ° С и относительной влажности воздуха 70-90%. В таких условиях через 25-30 дней после посева начинается обильное спороношение гриба.

 

Ашерсонию можно выращивать и на жидком сусле без агар-агара с сахаристостью 8-10% за pH 5-6. Сусло при этом разливают в колбы до половины объема, стерилизуют при 1 атм в течение 25 минут и после остывания высевают гриб, используя споров суспензию ашерсонии, выращенную на агаризованной сусле. На 1 л вносят 2-3 мл суспензии.

 

После посева культуры колбы ставят на электрическую скалку и взбалтывают в течение 3-х-4-х суток при температуре 24-25 ° С. Когда суспензия вступит сметанообразной консистенции, культуру разливают в эмалированные стерильные кюветы с плоским дном слоем в 1 - 1,5 см и ставят в освещенные, плотно закрыты шкафы с температурой 26-28 ° для стимулирования спороношения. На жидкой среде гриб развивается 15-20 дней. Полученную спороносную грибную пленку принадлежит сразу же использовать против оранжерейной белокрылки.

 

Биомассу Verticillium lecani получают за выращивание гриба на различных питательных субстратах: средах Чапека и Сабуро, пшене, на зерне ячменя и пшеницы, отходах крахмало-патоки, сахарных и других заводов, перерабатывающих сельскохозяйственное сырье.

 

Среды из зерна: зерно ячменя после трихограмного производства просушивают в сушильном шкафу для уничтожения насекомых, оставшихся и предотвращения Заплесневение. Сухим такое зерно может храниться долго.

 

Для приготовления среды в 0,5-литровые молочные бутылки насыпают 50 г сухого зерна и наливают 130 мл водопроводной воды и закрывают ватными пробками. Течение 5-7 часов зерно набухает, после чего на бутылки надевают бумажные колпачки, закрепляя резинками, и кладут в автоклав. Стерилизуют их при 1 атм в течение 1 часа. После стерилизации бутылки взбалтывают и раскладывают на стеллажах. На зерно, остыли, высевают споры гриба.

 

Среды на основе пивного сусла готовят так же, как и для ашерсонии.

 

Жидкие питательные среды готовят без добавления агар-агара. Гриб хорошо растет на разбавленном пивном сусле с содержанием 7-10% сахара по pH 6-6,5. Лучше всего он растет на среде следующего состава: кукурузный экстракт - 20 г, крахмал -20 г, сахароза - 20 г, соль - 2 г, СаС03 -2 г, 1 л воды из водопровода по pH - 6.

 

Питательная жидкую среду разливают по 80-100 мл в бутылки, стерилизуют, после посева гриба бутылки укладывают горизонтально на стеллажах. Культивирование осуществляют при температуре 2-26 ° С и влажности воздуха - 70%. Бутылки средой из зерна через 3-4 дня взбалтывают и переворачивают на другую сторону.

 

После 20-25-дневного культивирования гриба можно использовать для обработки растений.

 

Все больше внимания уделяется производству и применению грибов, специфически поражают сорняки. В промышленно развитых странах, включая США, Японии, сделаны попытки промышленного производства микогербицидив. Так, в США на основе спор гриба - возбудителя антракнозу - Colletotrichum gloeosporioide Penz. создан микогербицид для защиты от двух видов ешиномены (Aeschynomene virginica, A. indica).

 

Значительно большее значение приобрело производство и использование грибов-антагонистов и гиперпаразитив фитопатогенных микроорганизмов. В условиях биолабораторий производят биомассу нескольких таких грибов. Это виды родов Trichoderma, Ampelomyces, Coniothyrium.

 

Для получения биомассы грибов рода Trichoderma, в частности Т. lignorum, используют различные сыпучие субстраты: перегной, отходы зерна, свекольный жом, отруби, торф, другие растительные остатки.

 

Маточную культуру выращивают на агаризованных твердых и жидких средах (сусло, Чапека, картоплева т.п.). Срок хранения маточной культуры - 7-8 месяцев в холодильнике при температуре +5 ° С.

 

Для получения биопрепарата за поверхностного способа выращивания гриба на сыпучих субстратах можно использовать любую тару: молочные бутылки, медицинские металлические бюксы, чаны, котлы, эмалированные кастрюли, деревянные ящики, мешки с любой плотной ткани. Тару заполняют питательным субстратом на треть, увлажняют водой (70-80% от массы), плотно закрывают и стерилизуют в автоклаве под давлением 1 - 1,5 атм в течение 1 часа. После стерилизации субстрат охлаждают до 30-35 ° С и засевают заранее выращенной маточной культурой гриба.

 

Тару усеянным субстратом кладут на стеллажи в помещении с температурой 25-28 ° С. В первые 3-4 дня роста гриба особенно важно поддерживать стерильность в помещении и оптимальную температуру воздуха. На сутки температуру снижают до 20-22 ° С, чтобы предотвратить перегрев субстрата. На шесть-семь сутки роста гриба биопрепарат готов для применения. Если нет возможности применить сырым, его сушат в специальных помещениях при температуре 30-40 ° С, периодически перемешивая. Срок хранения биопрепарата влажностью 50-60% - 25-30 дней, 5-8% - 1,5 года. Сухой биопрепарат можно хранить в сухом прохладном помещении при температуре 5-10 ° С.

 

Массовое производство грибов рода Ampelomyces для собственных нужд начинают по выращиванию маточного культуры активного штамма гиперпаразита. Выращивают маточную культуру в 0,5-литровых или литровых бутылках на агаризованной сусле или картофельно-глюкозный среде.

 

Для получения биомассы гриба в бутылки засыпают 100 г отходов ячменя трихограмного производства, заливают 120-140 мл воды, закупоривают, взбалтывают, чтобы хорошо смочить зерно. Затем бутылки с зерном стерилизуют в автоклаве при 1 - 1,2 атм в течение 30 минут, охлаждают и вносят в стерилизованного бокса, где и высевают в каждую бутылку суспензию маточной культуры гриба.

 

Засеянные бутылки ставят в термостаты с температурой 22-24 ° С для впрошування гиперпаразита. При благоприятных условиях через 3-4 недели биомассу можно сушить.

 

Готового для применения в производственных условиях высушенного гриба можно хранить в сухом, прохладном месте не более 6 месяцев.

 

Известны работы по получению в условиях опыта биомассы ряда других грибов, зоопатогенних видов, видов, паразитирующих на сорняках, и гиперпаразитив, а также антагонистов. Среди них - грибы из родов Aspergillus, Paecilomyces, Basidiobolus, Fusarium.

 

Технология работы с ними принципиально не отличается от технологии получения боверии и других грибов.


Загрузка...
Яндекс.Метрика Google+