Описанная выше процедура сложная и позволяет получать лишь совсем незначительные количества рекомбинантной ДНК. Клонирование - это способ ее накопления. Понятие «клон» определяется как большая популяция идентичных молекул, бактерий или клеток-потомков одного предка.

 

После получения причудливых плазмид их вносят в среду, где находятся клетки хозяина, в данном случае кишечной палочки. При определенных условиях они включаются в бактериальные клетки и образуется рекомбинантная бактерия. Процесс введения плазмиды в клетку, вызывает в ней наследственные изменения, называется трансформацией. Эффективность проникновения эндогенной ДНК в клетку низкая. Для улучшения проникновения рекомбинантной ДНК плазмиды в клетку их обрабатывают различными способами, например растворами солей кальция хлорида, после чего мембраны клеток становятся проницаемыми для рекомбинантных ДНК.

 

В клетке плазмиды начинают размножаться (реплицироваться). После размножения вновь бактериальные клетки также содержат рекомбинантные плазмиды. Далее выращивают колонию клеток кишечной палочки в ферментерах с большими объемами на свежем питательной среде, увеличивая количество рекомбинантных плазмид до 1012.

 

При использовании большого количества бактериальных клонов, которые несут случайные фрагменты ДНК, нужный ген обязательно находится на каком-то клоне, который проявляется различными методами. Например, за биологической активностью полученного продукта: если это фермент, то он идентифицируется с участием в метаболизме определенных веществ, если интерферон - за противовирусной активностью, инсулин - за гормональной активностью и т.д. Однако самыми общими методами являются иммунологический анализ, который применяется как в случае прямой экспрессии, так и при синтезе рекомбинантных ДНК, а также гибридизация с синтетическим нуклеотидом, меченым 32Р.

 

Последний этап в работах по генетической инженерии - адаптация введенного гена в другом для него генетическом и физиологическом окружении и его экспрессия, то есть синтез специфического белка. Бактерии со встроенным чужим геном, делятся, синтезируют кроме своих белков и белок встроенного гена. Задача производства заключается в выделении и очистке полученного белка.

 

При введении ДНК эукариот в геном бактериальной клетки возникает ряд трудностей. Чтобы обеспечить транскрипцию встроенного гена часто перед ним на участке ДНК плазмиды располагают высокоэффективный промотор или используют метод слияния генов. При этом образуются объединены полипептиды. Затем их разделяют. Таким образом, например, был получен гормон соматостатин (см. выше).


Загрузка...
Яндекс.Метрика Google+