Зная первичную структуру белка и его генетический код, можно составить последовательность нуклеотидов в гене заданного белка, а затем синтезировать его. В этот способ можно получить небольшие гены длиной до двух десятков кодонов. Первый ген был синтезирован в 1969 г. группой Х.Кораны. Ген аланиновои тРНК дрожжей они получили путем сочетания синтетических мелких фрагментов (от 4 до 13 пар нуклеотидов) в необходимом порядке с помощью фермента ДНК-лигазы. В полученном гене хватало регуляторных участков, поэтому он был функционально неактивным. В 1976 г. Х.Корана и сотрудники синтезировали фрагмент ДНК кишечной палочки, который кодировал тирозинову тРНК, но к его концов они присоединили гибридные затравки - тетрануклеотиды ААТТ и ТТАА. Синтезированный ген оказался полностью активным. При вводе в мутантный штамм бактериофага Т4, в котором этого гена хватало, бактериофаг хорошо размножался в клетках кишечной палочки, то есть становился полноценным. Группа Г.Бойера осуществила химический синтез гена гормона сома-тостатину и ввела его в лактазной оперон кишечной палочки рядом с геном ?-галактозидазы (лактазы) (см. Регуляция биосинтеза белка). В результате бактерия начала вырабатывать белок, в котором одна часть была ?-галактозидазы, а вторая - соматостатином. Итак, транскрипция и трансляция этого гибрида осуществлялась за счет использования соответствующих регуляторных последовательностей ?-галакто-зидазы. В дальнейшем соматостатин было выделено в виде пептида. Эти блестящие эксперименты показали возможность создания химическим путем генов, которые не отличаются от естественных.

 

В дальнейших исследованиях по синтезу генов начали применять менее трудоемкий и быстрый метод - синтез с участием фермента обратной транскриптазы (ревертазы). Этот фермент присутствует в некоторых РНК-вирусов, в которых генетическая информация хранится в ДНК, а в РНК (см. Виды переноса генетической информации). При изучении этого фермента было выяснено, что матрицей для образования ДНК может служить даже синтетическая мРНК. Это открывало новые пути для синтеза различных генов с матричной РНК. Если in vitro в специальную инкубационный смесь добавить определенную мРНК (например, мРНК проинсулина), то синтезируется ген, комплементарный именно этой мРНК, в котором закодирована структура соответствующего белка (проинсули-на). На мРНК ревертаза синтезирует комплементарную ей ДНК-копию (кДНК). Поэтому работу начинают с выделения и очистки нужной мРНК из смеси многих различных мРНК. Для этого используются специализированные клетки, продуцирующие преимущественно определенный вид белка. Например, с ретикулоцитов - незрелых кровяных клеток, в которых содержится много гемоглобина (90% от всех белков), выделяют мРНК для получения а-и ?-полипептидных цепей гемоглобина из клеток инсулиномы - опухоли ?-клеток поджелудочной железы выделяют мРНК проинсулина , из лейкоцитов - мРНК интерферона и т.д. Клетки разрушают, собирают центрифугированием рибосомы (полисомы), обрабатывают их антителами против того белка, ген которого стремятся получить. Белок, который нас заинтересовал, но еще прикреплен к полису, синтезирующих его на матрице мРНК, взаимодействуя со специфическими антителами, выпадает в осадок. Специфические мРНК, на которых синтезировался белок, можно потом удалить из осадка с помощью хроматографических методов практически в чистом виде, то есть без примесей других мРНК. Теперь полученную специфическую мРНК используют как матрицу для ферментативного синтеза кДНК с помощью ревертазы. Однако для функционирования ревертазы необходима затравочного ДНК. Как известно, на 3'-конце молекул мРНК уже поли (А)-хвост (см. Процессинг пре-мРНК). Поэтому к мРНК добавляют поле (Т)-хвост, который с поли (А)-хвостом образует двохланцюгову участок, служит затравкой для ревертазы (рис. 84). В образованном гибриде мРНК-кДНК устраняется цепь мРНК с помощью ферментов РНКазы, и на однол-нцюговий кДНК с помощью ДНК-полимеразы и достраивается вторая цепь кДНК. В результате образуется двухцепочечная кДНК, которая затем соединяется с необходимым вектором (см. ниже). В лабораториях разных стран в этот способ были синтезированы гены, кодирующие белки человека, кролика, мыши, гены вируса осповакцины, некоторых бактериофагов и т.д.. Однако необходимо учитывать, что при использовании мРНК как матрица для синтеза ДНК образуется не весь ген с регуляторными участками, а только структурная информационная часть. Поэтому еще более сложной задачей является выделять готов ген из генома клетки. Это связано с тем, что на долю каждого гена приходится лишь небольшая часть всего генома и, кроме того, многие гены эукариот построены сложно, иногда состоят из ряда отдельных участков, расположенных на разных участках генома. Поэтому всю клеточную ДНК расщепляют на фрагменты с помощью обработки специальными ферментами - рестриктуючимы эндонуклеазами (РЕСТРА-ктазамы), многие из которых дают двухцепочечные разрывы только в ограниченных участках ДНК с образованием так называемых «липких» или «тупых» концов. Биологическая роль этих ферментов в организме заключается в том, чтобы расщеплять чужеродные молекулы ДНК, в то время как собственная клеточная ДНК при этом не расщепляется, поскольку участки, узнаются своими рестриктазами, у нее защищены (метилированных).

 

На сегодня из различных видов бактерий уже выделено, изучены и занесены в картотеку по механизму действия около 200 различных рестриктаз, некоторые из них широко применяются в генетической инженерии. РЕСТРА-ктазы совершили переворот в анализе ДНК. Расщепляя ДНК на относительно небольшие фрагменты в четко определенных местах, они отличаются от большинства других ферментов, химических или физических воздействий, вызывающих случайные разрывы цепей ДНК. Поэтому рестриктазы являются незаменимыми инструментами для исследования структуры хромосом, определения последовательности нуклеотидов в очень длинных молекулах ДНК, выделения генов и получения новых гибридных ДНК. Важное значение приобретает тот факт, что определенные РЕСТРА-ктазы распознают специфические последовательности нуклеотидов в ДНК длиной от 4 до 6 пар оснований и гидролизуют фосфодиефирни связи в обоих цепях в этой зоне. Если с помощью рестриктаз две цепи ДНК расщепить наискось, то образуются выступающие, комплементарные одноланцюгови «липкие» концы, а когда прямо - то «тупые» (см. ниже). При расщеплении одной и той же рестриктазы различных (двух) ДНК образуются одинаковые «липкие» концы и полученные фрагменты могут комплементарно сочетаться между собой этими концами ДНК-лигазы при условии, если смешать эти ДНК, нагреть до 70 ° С и медленно охлаждать. Таким образом образуются новые ковалентно сшитые рекомбинантные ДНК (рис. 85).

 

Разные ДНК можно соединить с помощью ДНК-лигазы и «тупыми» концами, при участии фермента - конечной нуклеотидилтрансферазы. Этому фермента не нужна матрица, поэтому он в состоянии построить только 3'-концевые последовательности, составленные из нуклеотидов одного типа, то есть к З'-концу одного фрагмента присоединяется один гомополину-клеотид, например, поли (А), а к 3'- концу второго фрагмента соответствии поле (Т). Поскольку такие последовательности комплементарные друг другу, то с помощью них можно совместить две ДНК. Объединить молекулы можно сочетанием их концов с синтетическими, так называемыми «линкерами». Обычно в качестве линкера используются самок-плементарни олигонуклеотиды длиной 8-10 нуклеотидных остатков, чувствительны к расщеплению любой рестриктаз.


Загрузка...
Яндекс.Метрика Google+