Нуклеотидный состав ДНК и РНК. Полинуклеотидных цепей нуклеиновых кислот в клетке сочетаются во многих случаях с белками, образуя нуклеопротеинов. PHK входит в состав рибонуклеопротеинив (РНП), ДНК - дезоксирибонуклеопротеинов (ДНП). Обычно для установления нуклеотидного состава нуклеиновых кислот нуклеопротеиды экстрагируют из клеток 1M раствором нейтральных солей. Белковую часть отделяют, используя раствор фенола, смесь хлороформа с изоамилового спирта, а также детергенты, например, додецилсульфат натрия, или используют расщепление белков ферментами протеи-назамы. После отделения белка нуклеиновую кислоту осаждают, постепенно добавляя этиловый спирт, а затем определяют нуклеотидный состав, т.е. набор и порядок расположения нуклеотидов, служит очень важной характеристикой нуклеиновых кислот. Один из основных путей определения нуклеиновых кислот основывается на исследовании продуктов их гидролиза. Поскольку мижнуклеотидни связи в полинуклеотидов является сложноэфирная, то они могут гидролизоваться как в кислой, так и в щелочной среде. Химический гидролиз ДНК почти не используют из-за осложнения его побочными процессами. Преимущественно используют ферментативный гидролиз с участием ферментов нук-леаз. Нуклеазы специфичные для типа нуклеиновых кислот, их разделяют на рибонуклеазы и дезоксирибонуклеаза. Изъятие и идентификацию компонентов нуклеиновых кислот осуществляют с помощью физико-химических методов (хроматография, электрофорез и др.).. Пиримидиновые и пуриновые основания обычно идентифицируют с помощью УФ-спектроскопии.

 

Кроме определения нуклеотидного состава, важной задачей является также установление нуклеотидной последовательности, т.е. порядка чередования нуклеотидов. Общий подход заключается в использовании блочного метода. Сначала полинуклеотидной цепи направлено расщепляют на мелкие блоки - олигонуклеотиды - и определяют их нуклеотидную последовательность. Для разделения молекул ДНК на фрагменты используют ферменты рестриктазы, поскольку они «разрезают» молекулу ДНК в определенных местах, а именно там, где расположены специфические последовательности нуклеотидов в ДНК.

 

В настоящее время выделено и изучено большое количество рестриктаз и составлен картотеки их действия. Используя рестриктазы, можно разрезать молекулу ДНК на большое количество фрагментов, конечные последовательности которых известны, поскольку они зависят от вида используемой рестриктазы. Полученные фрагменты разделяют методом электрофореза в полиакриламидном геле. Последовательность нук-леотидив в коротких фрагментах ДНК определяют с помощью ряда методов. Однако необходимо знать, в каком порядке находятся фрагменты в целом молекуле ДНК. С этой целью ДНК разрезают с помощью другого набора рестриктаз, получают другой набор фрагментов, а затем вновь определяют последовательность нуклеотидов. Перекрытие последовательностей, определенных с помощью различных методов резки, позволяет установить с помощью ЭВМ порядок расположения фрагментов. Этот метод определения последовательности нуклеотидов в ДНК получил название секвенирование.


Загрузка...
Яндекс.Метрика Google+