Выделение и очистка белков. Первым этапом выделения и очистки белков является изъятие их из клеток. Сначала клетки разрушают, превращая их в гомогенат с помощью гомогенизаторов с лопатками, вращающимися или пестика , изготовленные из инертного материала - тефлона. Применяют также метод растирания с твердым материалом, например, с кварцевым песком. Существуют методы разрушения клеток с помощью попеременного замораживания и размораживания. На всех этапах выделения и очистки белков следует учитывать их значительную неустойчивость, лабильность, склонность к потере нативных свойств. Очень часто процесс разрушения клеток сопровождается выделением тепла, поэтому все процедуры необходимо проводить при пониженных температурах (около +4 ° С) с целью предотвращения тепловой денатурации. Важно также поддержания активной реакции среды в определенном интервале, с этой целью среду суспендирования готовят на буферных растворах. Чтобы устранить влияние различных ионов, используют комплексообразователь - етилендиаминтетрааце-тат (ЭДТА или трилон Б) и др.. Чтобы предотвратить окисление в белках SH-групп, в среду добавляют восстановители, например цистеин и др.. Для выделения белков клеточных органелл последние сначала получают с помощью ультрацентрифугирования. Большинство белков в клетке находится в сочетании с другими веществами или клеточными структурами, для их лучшей солюбилизации применяют слабые растворы детергентов - веществ с поверхностной активностью (дезоксихолат натрия и др.). Или некоторые растворители (эфир, бутанол и т.д.).

 

Белки экстрагируют из материала после его гомогенизации. В зависимости от свойств удаленного белка и цели исследования применяют различные растворители: воду, солевые растворы, различные буферные смеси, водно-спиртовые растворы, слабые кислоты или щелочи, органические реагенты. Очень часто экстракцию белка осуществляют в процессе гомогенизации материала. Результате экстракции получают смесь белков и других веществ, поэтому применяют различные методы очистки (высаливания, изоэлектрической осаждения, применения органических растворителей при низкой температуре от 5 ° до 10 ° С), используется ионообменная, адсорбционная или аффинная хроматография с различными адсорбентами, гельфильтрация на колонках, электрофорез. Применяя различные методы выделения и очистки белков, можно получить индивидуальные белки с высокой степенью чистоты. Основными тестами на гомогенность полученного белка является стабильный аминокислотный состав, определенная молекулярная масса, движение при электрофорезе в виде одной полосы, проявление определенной биоактивности.

 

Молекулярная масса. Молекулярная масса белков очень велика - от нескольких тысяч до миллионов дальтон. Считают, что соединения с молекулярной массой <6000 относятся к полипептидов, а> 50000-60000 - до олигомеров. Среднее значение молекулярной массы белков приведены в табл. 2. Наиболее распространенными методами ее определения является ультрацентрифугирования, гель-электрофорез, гель-фильтрация, осмо-метрический, диффузионный метод, РСА, метод электронной микроскопии и др.. В 30-х годах XX в., Когда шведским ученым Т.Сведбергом была сконструирована ультрацентрифуге, началось широкое использование гравитационных методов, или седиментационных анализа, который позволяет наблюдать процесс седиментации (оседания) частиц. В современных ультрацентрифуге развивается центробежное ускорение, превышающее ускорение силы тяжести в 500000 раз.

 

Скорость оседания белков зависит от величины центробежной силы, формы и размера молекул белка и называется коэффициентом седиментации. Единицей измерения является секунда (с). Значения коэффициентов седиментации - в пределах (1-200) -10-13 с. Величина коэффициента седиментации, равной 1-10-13с, принята за единицу и назван «единицей сведе-берга». Она обозначается буквой S. Следовательно, S равен 1-10-13с. В соответствии со значением коэффициента седиментации рассчитывают молекулярную массу белков с помощью так называемого уравнения Сведберга.


Загрузка...
Яндекс.Метрика Google+