Феномен позиционирования нуклеосом относительно последовательности пар оснований проявляется в том, что некоторые участки последовательности есть несколько лучше других для образования там нуклеосом. Лучшими в энергетическом смысле: эксперименты, в которых сравнивалась относительная эффективность реконструкции нуклеосом на разных последовательностях ДНК, свидетельствуют, что последовательности могут различаться между собой по свободной энергией образования нуклеосом на величину до ~ 6-7 kT. Однако, это скорее предельные случаи: обычно разница энергий между различными последовательностями составляет ~ 2 kT.

 

Чтобы выяснить, что такие значения свободной энергии могут означать в терминах вероятности заполнения тех или иных позиций, рассмотрим простой гипотетический случай. Пусть на некотором фрагменте ДНК длиной N = 204 пары оснований (максимально N - 144 = 60 позиций для нуклеосомы, содержащий 145 пар оснований) есть только одна позиция, расположение нуклеосомы в которой сопровождается относительным снижением свободной энергии на AAG = -2 kT - свободные энергии для всех остальных позиций примем нуля. Тогда вероятность нахождения нуклеосомы на подавляющем позиции по принципу Больцмана пропорциональна exp (-AAG) = 7,39, на всех остальных позициях - до 1. Нормирование по всем позициям дает вероятность найти нуклеосому в подавляющем позиции против вероятности для каждой из остальных позиций 0,01. Снижение относительной свободной энергии подавляющего позиции до -6 kBT приводит к повышению первого вероятности до 0,87 и снижение двух до 0,002. Таким образом, позиционирование нуклеосом не является жестко детерминированным - речь всегда идет о большей или меньшей вероятности присутствия нуклеосомы в данном сайте.

 

Свободная энергия образования нуклеосомы определяет "силу" данной позиции, а конкретный энергетический профиль вдоль ДНК-сложную картину преимущественного позиционирования. Например, обычно на фрагментах длиной 200-250 пар оснований регистрируются 2-3 альтернативные преобладающие позиции. Кроме того, для появления регулярной картины позиционирования нуклеосом может быть достаточным существование на определенном участке только одной "сильно" позиционированный нуклеосомы, которая задает рамку расположение для других нуклеосом (рис. 4.1, а). То есть, нуклеосомы, расположены по сильно позиционированный, занимают не предпочтительны, а просто доступные позиции, не перекрываются. В результате на участке определенной длины нуклеосомы оказываются фазированной - наблюдается их упорядоченное расположение, когда на многих фрагментах ДНК, анализируются, в той же области с высокой вероятностью находится нуклеосома - так называемое статистическое позиционирования. На удалении от позиционированный нуклеосомы накапливаются случайные сдвиги нуклеосом в ту или иную сторону, и регулярность их расположения нарушается - на многих фрагментах ДНК нуклеосомы хаотично занимают места перекрываются. Если две альтернативные сильные позиции перекрываются, избирается та из них, что является более предпочтительной (рис. 4.1, б) - она задает рамку фазированных нуклеосом. Но в пределах этой позиции может быть расположен специфический регуляторный сайт-связывания с ним транскрипционного фактора приведет к реализации другой подавляющего позиции и другой рамки расположения нуклеосом (рис. 4.1, в). Понятно, специфически связан белок сам по себе способен определять рамку фазировки. И наоборот: распределение нуклеосом определяет доступность элементов последовательности ДНК для различных ДНК-связывающих белков. Доступность регуляторного элемента нуклеотидной последовательности не обязательно связана с его расположением в Линкер - достаточно короткие сайты связывания могут находиться внутри нуклеосомнои ДНК, и тогда их доступность зависит от того, на какой стороне дуплекса - обратного наружу или к поверхности октамер гистонов - они находятся. Поскольку для осуществления контактов между ДНК и гистонами маленький желобок должен стать точно против сайта связывания на октамер, трансляционный сдвиг нуклеосомы приводит к одновременному прокрутки дуплекса - меняется так называемая ротационная позиция. При смещении на пиввитка двойной спирали экспонированные сайт становится недоступным и наоборот (рис. 17, цвет. В ст.).

 

Ответ на вопрос, каково происхождение имеет энергетический профиль вдоль последовательности ДНК, он определяет позиционирование нуклеосом, уже дана в подразделе 3.2: только один вклад в свободную энергию образования нуклеосомы - энергия деформаций двойной спирали - существенно зависит от последовательности пар оснований. Разница между энергиями деформации различных участков (на уровне ~ 2 kT или иногда больше) и является главным механизмом преимущественного позиционирования нуклеосом относительно последовательности.

 

Зависимость конформации ДНК и потенциала по ее изменений от последовательности иллюстрирует таблица 4.1, где представлены конформационные параметры динуклеотидних шагов различного типа в составе белково-нуклеиновых комплексов. Эти значения являются средними для данного типа контакта между парами оснований в 92 кристаллических структурах, где не наблюдается значительных деформаций ДНК (нуклеосома не вовлечена в этого массива данных). То есть, хотя влияние белков на конформацию ДНК в этих комплексах безусловно имеет место, эти данные являются неплохим приближением к структурных параметров свободной ДНК в растворе при физиологических условиях.

 

Как видно из таблицы, конформационные параметры - особенно это касается Твиста, ролла и слайда - весьма существенно зависят от типа контакта между парами оснований. В табл. 4.1 представлены также стандартные отклонения конформационных параметров, которые показывают, насколько легко параметра может отклоняться от преимущественного среднего значения. То есть, стандартные отклонения является мерой конформационной подвижности контакта данного типа. Среди шести конформационных параметров два - твист и ролл - в наибольшей степени (т.е. с наименьшими энергетическими затратами) способны отклоняться от своих равновесных значений. Такое отклонение отвечает двум главным типам деформации двойной спирали - торсионное закручивания / раскручивания (изменение Твиста) и изгиб (изменение ролла). При этом двойная спираль характеризуется анизотропией по изгибу - подавляющий вклад именно ролла, а не тилта, в изгиб ДНК приводит к тому, что двойная спираль значительно легче изгибается в сторону желобков, чем в сторону цукрофосфатного остова (что вполне понятно интуитивно и полностью подтверждается анализом структуры ДНК в нуклеосомы, пидпидрозд. 3.1.2). Всего способность динуклеотидного контакта в конформационных изменений зависит от эффективности стекинг-взаимодействий между данными парами оснований, числа водородных связей в парах и типа екзоцикличних групп в желобкам. Все это определяет доступен конформационный пространство и энергию, которую необходимо затратить на деформацию. В целом наблюдается следующая тенденция: пиримидин-пуриновые (YR) динуклеотидни шаги являются наиболее конформационные подвижными, пурин-пиримидиновые (RY) - наименее, шаги RR / YY занимают промежуточное положение. Среди шагов одного класса более подвижными являются шаги, обогащенные на АТ-пары: например, для YR контактов подвижность относительно твист и ролла снижается в ряду TA> CA / TG> CG. Таким образом, наиболее конформационные подвижным среди всех контактов есть контакт И: упомянутая в разделе 3.1.2 "сильно" позиционированный нуклеосома-601 содержит контакт И в пяти позициях, где маленький желобок обращен к поверхности октамер гистонов, еще в четырех таких позициях расположены другие пиримидин-пуриновые контакты - именно это, главным образом, и минимизирует энергию изгиба и, соответственно, обуславливает высокую склонность последовательности 601 до образования нуклеосомы. Следует заметить, что характер зависимости конформации ДНК от последовательности самом деле более сложным: конформационные особенности определяются не только ближайшими соседями - типом контакта между парами оснований, но в известной мере и контекстом последовательности, где данный контакт находится.

 

Поскольку различные элементы последовательности (минимальные-динуклеотидни шаги) различаются между собой по потенциалу относительно определенных деформаций, важнейшими из которых для нуклеосомы являются изменения ролла, твист и слайда (пидпидрозд. 3.1.2), в нуклеосомних ДНК проявляются определенные закономерности частоты встречаемости различных динуклеотидов в различных позициях. Например, анализ последовательностей ДНК, выделенных из тотального препарата нуклеосом дрожжей указывает на то, что АТ-обогащенные шаги чаще встречаются там, где маленький желобок контактирует с поверхностью октамер гистонов, а GC-обогащенные чаще расположены в противоположной фазе (рис. 4.2). Аналогичные статистические закономерности выполняются и для других эукариотических геномов, а также для нуклеосом реконструированных in vitro на геномных ДНК. Последнее обстоятельство указывает на то, что именно последовательность ДНК, а не другие факторы (конкуренция других белков, специфические механизмы репозиционирование при ремоделировании хроматина (см. следующий раздел), наднуклеосомна структура хроматина т.п.) является главным фактором позиционирования. Установлены статистические закономерности можно использовать для предсказания позиций нуклеосом, ища участки с наиболее благоприятным для образования нуклеосом распределением динуклеотидов. Предсказательная сила таких алгоритмов достигает 50% - но не больше. Наверное, от статистических подходов и не следует ожидать лучшего. Статистические закономерности возникают в результате усреднения по многим последовательностям, в результате чего существенно уменьшается "шум": каждая индивидуальная нуклеосомна ДНК характеризуется распределением динуклеотидов, который лишь немного отличается от случайного.

 

Более перспективными являются подходы, основанные на прямой оценке свободной энергии деформации ДНК определенной последовательности. Однако они пока не способны привести к лучшим результатам. Наиболее полным на сегодня источником информации о зависимых от последовательности эластичных свойств ДНК данные, полученные из кристаллов белково-нуклеиновых комплексов (табл. 4.1). Но, во-первых, массив этих данных является недостаточно большим для надежной оценки стандартных отклонений всех конформационных параметров для всех динуклеотидних шагов. Во-вторых, эластичные особенности зависят от типа динуклеотид лишь в первом приближении - имеет значение также контекст последовательности. В-третьих, кристаллографические данные всегда оставляют вопрос о степени влияния сил упаковки кристаллов на исследуемые параметры. В-четвертых, в белково-нуклеиновых комплексах ДНК уже более-менее деформированной (хотя наиболее деформированные комплексы исключаются из анализа по оценке конформационных параметров), а рассчитывать энергию деформации в нуклеосомы следует относительно свободной ДНК в растворе. Наконец, сама нуклеосомна ДНК отличается структурным полиморфизмом, и адекватной оценкой энергии ее деформации разница между состояниями свободной ДНК, и такой нуклеосомнои, которая минимизирует деформацию при обеспечении прочных контактов с гистонами. Дальнейшее развитие указанных подходов на основе накопления знаний о физических свойств ДНК может открыть новые возможности анализа геномных последовательностей.

 

Развитие современных геномных технологий сделало возможным тотальное экспериментальное картирования позиций нуклеосом в масштабе целого генома с высоким разрешением. Процедура такого картирования, как правило, включает следующие этапы (с некоторыми возможными вариациями). Живые клетки обрабатывают формальдегидом, пришивая все хроматина белки (в первую очередь - гистоны) к ДНК, выделяют хроматин и обрабатывают его микрококковою нуклеаз. Микрококкова нуклеазы-неспецифическая эндонуклеаза, осуществляющего двухцепной разрез. Поскольку оба цепи доступны только в линкера (в нуклеосомы один из цепей всегда связан с октамер гистонов), только линкерни участки подвергаются деградации. В свое время результаты обработки хроматина микрококковою нуклеазы стали одним из первых доказательств нуклеосомнои организации хроматина: мягкая обработка нуклеазы производит набор фрагментов ДНК с длиной, кратной нуклеосомному повтора, - на электрофореграмме препарат ДНК имеет характерный вид "лестницы" фрагментов, длина которых соответствует моно -, ди-, три-и т.д. - Олигонуклеосомам. Обработка нуклеазы течение большего времени производит отдельные мононуклеосомы - так называемые нуклеосомни кор-частицы, содержащие ДНК длиной ~ 145 пар оснований.

 

На следующем этапе полученный материал - нуклеосомни кор-частицы - осаждают антителами к гистонов (канонических гистонов, определенных гистоновых вариантов или гистонов, содержащие определенные посттрансляционной модификации) - описаны этапы соответствуют стандартной процедуре имунопреципитации хроматина (ChIP - Chromatin ImmunoPrecipitation). Далее после разрушения сшивки получают набор фрагментов ДНК, входивших в состав нуклеосом. На завершающем этапе с помощью одного из автоматических экспресс-методов секвенирования устанавливают нуклеотидные последовательности нуклеосомних ДНК - все фрагменты или секвенують полностью (методом пиросеквенування), или устанавливают лишь небольшие участки на 5-концах (определяют границы нуклеосомних ДНК-используя технологии Illumina-Solexa или Applied Biosystems SOLiD). После этого остается найти места полученных последовательностей в известной полной последовательности генома - установить позиции нуклеосом.

 

Последнее время накоплен данные относительно такого картирования в геномах дрожжей, нематоды, дрозофилы и человека. Конечно, каждый участок генома имеет свои тонкие особенности по позиционированию нуклеосом. В частности, участки, где проявляется четкий паттерн позиционирования (рамка фазированных нуклеосом), меняются участками, где этот паттерн является размытым (позиции нуклеосом перекрываются). Спозиционированный нуклеосомы в исследованных в этом отношении геномах имеют тенденцию быть расположены на более или менее фиксированных расстояниях друг от друга: в геноме дрожжей S. cerevisiae соседние нуклеосомы зачастую расположены на расстоянии ~ 165 п.о. (Линкер длиной ~ 20 п.о.), у дрозофилы D. melanogaster и нематоды Caenorhabditis elegans -175 п.о. (Линкер ~ 30 п.о.), геноме человека -185 п.о. (Линкер ~ 40 п.о.).

 

Наиболее впечатляющие общие закономерности проявляются относительно расположения нуклеосом относительно стартовых точек транскрипции (рис. 4.3). В отрицательном направлении (противоположном по отношению к направлению транскрипции) на расстоянии -220 пар оснований от стартовой точки часто расположена позиционированный нуклеосома (обозначается -1 на рис. 4.3, позиция нуклеосомы определяется как позиция центральной точки нуклеосомнои ДНК). Сразу за ней в положительном направлении часто расположена зона, свободная от нуклеосом (NFR - Nucleosome-Free Region), длиной ~ 150 пар оснований - пробел, где могла быть размещена одна нуклеосома (следует заметить, что для генома человека именно эту - часто отсутствующую - нуклеосому обычно обозначают как -1, с целью унификации мы не будем использовать это обозначение). За этой зоной, которая обозначается как 5-NFR, после стартовой точки, размещена сильно позиционированный нуклеосома +1. В геноме дрожжей граница этой нуклеосомы практически совпадает со стартовой парой основ, у многоклеточных эукариот граница нуклеосомы +1 расположена через ~ 10 пар оснований в положительном направлении от стартовой точки в неактивных промотора, но через ~ 40 пар - в активных. Нуклеосомы +1 вообще относятся к наиболее сильно позиционированный в геноме. Таким образом, две соседние участки - с очень низким и очень высоким потенциалом по созданию нуклеосом - маркируют старт транскрипции. Нуклеосома +1 задает рамку фазированных нуклеосом в кодирующей части гена, которая впоследствии "затухает" и усредненный распределение становится хаотичным. В области терминации транскрипции является другая характерная зона, свободная от нуклеосом, - 3'-NFR (рис. 4.3). В достаточно "компактном" геноме дрожжей 3'-NFR часто выступает и как 5-NFR для соседнего гена.

 

Понятно, что 5-NFR является зоной сборки преинициаторного комплекса РНК-полимеразы, а 3'-NFR - сборники мультибилкового комплекса, от которого зависит терминации транскрипции (раздел 5). В принципе можно предположить, что существование обоих этих зон является просто следствием транскрипции - удаление нуклеосом с промоторов и терминаторов активных генов. Но зоны, обедненные на нуклеосомы, регистрируются также и в неактивных генах. Кроме того, общая картина позиционирования нуклеосом очень подобной в живых клетках дрожжей и в хроматине, реконструированном на дрожжевой ДНК in vitro, - то есть тогда, когда остается только последовательность пар оснований в качестве единственного фактора позиционирования. Между делениями нуклеосом in vitro и in vivo есть определенные отличия (появление или исчезновение некоторых нуклеосом, изменение трансляционных позиций), но они выглядят как модуляции позиционирования за счет специфических факторов. Итак, главным фактором, определяющим позиции нуклеосом, является последовательность пар оснований, в том числе это касается особенностей распределения нуклеосом в зоне стартовых точек транскрипции. В частности, в составе 5-NFR дрожжей часто встречаются треки poly (dA)-poly (dT) - такие участки характеризуются повышенной жесткостью по изгибу, что способствует формированию свободной от нуклеосом пробелы.

 

Вполне возможно, что именно особенности расположения нуклеосом и определяют эукариотический промотор. В зоне старта транскрипции (так называемом базальном промотор) часто встречаются стандартные элементы последовательности (в частности, ТАТА-бокс). Но большая часть эукариотических промоторов не содержит таких элементов - как в таких случаях система транскрипции определяет промотор, оставалось не совсем понятным.


Загрузка...
Яндекс.Метрика Google+