Конформационная подвижность нуклеосомы в циркулярных ДНК. Поскольку in vivo нуклеосомы находятся в составе петельных доменов хроматина, влияние топологических ограничений, которые существуют в таких доменах, на структурную динамику нуклеосом является важным физиологическим фактором.

 

Каждая петля с зафиксированными концами топологически эквивалентна к циркулярной ДНК. Центральным понятием топологии циркулярной ДНК является так называемое число зацеплений Lk (linking number) двух полинуклеотидных цепей - двух колец, закрученных одна вокруг друга в двойную спираль. Число зацеплений определяется как число связей одним циркулярным контуром поверхности натянутая на второй контур: соответственно Lk может быть только целым числом. Любые деформации колец (при условии сохранения целостности каждого кольца) не изменяют этой величины: кольца нельзя ни развести, ни увеличить степень зацеплений. Следовательно, и это вторая важная свойство числа зацеплений, Lk системы двух колец является постоянной величиной-топологическим инвариантом, - пока оба кольца являются интактными (не содержат разрывов). Эти два свойства числа зацеплений и накладывают топологические ограничения на молекулу циркулярной ДНК. Одинаковые циркулярные молекулы, различающиеся по числу зацеплений, называют топоизомерамы.

 

В общем случае число зацеплений любой циркулярной ДНК (или ДНК с зафиксированными концами) подчинено известному уравнению Калугареану-Уайта-Фуллера (Gheorghe C?lug?reanu, James White, F. Brock Fuller):

 

Lk = Tw + Wr,

 

где Tw (twist) - твист - количество витков двойной спирали (равна сумме углов твиста для всех пар оснований, разделенной на 360 °, с пометкой "+" для правой спирали "-" для левой), Wr (writhing) - райзинг - параметр, который является мерой отклонения оси двойной спирали от планарной конфигурации (для планарного кольца Wr = 0). Распределение величины Lk по двум составляющей Наиболее выгодный твист ДНК Tw0 (для которого чаще используют эквивалентное обозначение Lk0) определяется внешними условиями и последовательностью пар оснований (типичное среднее значение при физиологических условиях соответствует примерно 10,5 парам оснований на виток двойной спирали). Если, как это часто бывает, Lk Ф Tw0, в ДНК присутствует деформация (отклонение конформации от наиболее выгодного), и эта деформация минимизируется, распределяясь определенным образом между изменением Твиста A Tw = Tw - Tw0 и ненулевым райзингом вследствие роста изгиба молекулы. Итак, общей мерой деформации является величина

 

ALk = Lk - Lko = ATw + Wr. (3.2)

 

Поскольку рост райзинга (при росте общие деформации) связано с спирализации оси двойной спирали-надспирализациею (supercoiling), величина ALk используется как мера надспирализации в циркулярной ДНК. Таким образом, надспирализация является тем большей, чем больше Lk отличается от Lk0, и чем больше напряжение, связанное с деформацией, накапливается в ДНК.

 

Одним из основных источников возникновения надспирализации в живых системах являются разнообразные функциональные процессы, осуществляемые на ДНК, - в первую очередь, транскрипция и репликация. Прохождение такого процесса связано с передвижением (транслокацией) вдоль ДНК того или иного фермента (транслоказы), который локально разрушает двойную спираль. Транслоказамы являются, РНК-и ДНК-полимеразы, а также другие ферменты. Поскольку молекула ДНК - спираль, передвижения транслоказы должно сопровождаться или ее вращением вокруг оси двойной спирали (вроде вращения гайки вокруг винта), или прокруткой самой двойной спирали (вращением винта в гайке). Именно вторая возможность и реализуется, поскольку транслоказа работает обычно в составе огромного мультибилкового комплекса - "гайка" слишком массивной. Кроме того, вращение транслоказы дополнительно тормозится взаимодействиями с ДНК, реализуются не только в области активного центра транслоказы. Иногда трансклоказа вообще не способна вращаться, поскольку сама зафиксирована на элементах ядерного матрикса. Если концы ДНК жестко зафиксированы и не могут вращаться, транслокация будет создавать топологические проблемы (рис. 3.9).

 

В процессе передвижения вдоль ДНК транслоказа разрушает двойную спираль впереди себя и восстанавливает ее сзади. Локальное раскрутки двойной спирали впереди транслоказы должен быть компенсированным положительной надспирализациею, восстановления спирали (закручивание)-надспирализациею отрицательной. В результате спереди и сзади от транслоказы возникают две "волны" надспирализации противоположного знака. Две волны надспирализации, возникающие в процессе работы РНК-полимеразы, были продемонстрированы экспериментально, причем как in vitro, так и in vivo. В первом случае эксперимент заключался в осуществлении транскрипции in vitro на циркулярной плазмиде в присутствии фермента, который способен снимать только негативную надспирализацию: аннигиляции двух волн не происходило, и после остановки реакции матрица представляла собой смесь положительных топоизомерив. Эксперименты in vivo осуществляются, например, путем вырезания и замыкания в кольцо определенного фрагмента ДНК в клетке специфическим ферментом. Кольцо выделяется и используется как "свидетель" - оно содержит надспирализацию, что присутствовала в определенной геномной зоне. Когда такой фрагмент находится в промотора (позади полимеразы), интенсификация транскрипции приводит к накоплению отрицательной надспирализации.

 

Понятно, что накопление надспирализации (эластичной напряжения) не может продолжаться бесконечно: в конце концов напряжение будет блокировать процесс транслокации. Соответственно, должен быть способ решать эту проблему - снимать надспирализацию, релаксируя ДНК. Инструментом, который для этого используется клеткой, есть специальные ферменты - ДНК-топоизомеразы, способные осуществлять релаксацию ДНК (снимать надспирализацию), индуцируя временной разрыв полинуклеотидной цепи. После зашивания разрыва образуется топоизомер, Lk которого является максимально близким к Lk0. Однако, топоизомеразы не могут реагировать на возникновение надспирализации внезапно - им требуется определенное время на связывание с ДНК и осуществления релаксации. Оказывается, что часть эластичной напряжения могут снимать нуклеосомы за счет своей конформационной подвижности.

 

С нуклеосомы в составе циркулярных молекул ДНК связана давняя проблема так называемого парадокса надспиральности. Вследствие формирования левой суперспираль (отрицательное значение райзинга), нуклеосома вносит в циркулярную ДНК положительную надспирализацию - или, что то же самое, фиксирует на себе часть негативной надспирализации, если она присутствовала в циркулярной ДНК. Если осуществить реконструкцию нуклеосом на циркулярной плазмиде в присутствии эукариотической топоизомеразы I (которая снимает напряжение в линкерних участках), то в полученной таким образом циркулярной минихромосоми минимизированы эластичные напряжения. Количество нуклеосом в минихромосоми подсчитывается под электронным микроскопом. Далее нуклеосомы удаляются - свободная циркулярная ДНК содержит негативные надспиральни витки (эластичные напряжения), которые высвободились в результате удаления нуклеосом (были зафиксированы нуклеосомы). Количество этих надспиральних витков (степень надспирализации) можно оценить с помощью электрофореза - более надспирализована ДНК обладает повышенной электрофоретической подвижностью вследствие роста степени компактности. В таких экспериментах было установлено, что снижение числа зацеплений в минихромосоми относительно свободной циркулярной ДНК, релаксованои в таких же условиях, практически равно количеству нуклеосом. То есть, число надспиральних витков, зафиксировано одной нуклеосомы, Mkn = -1.

 

В топологическом смысле нуклеосомна суперспираль имеет два витка - если линкерна ДНК продолжает по прямой траектории, заданную нуклеосомною суперспираллю, происходит два отрицательных пересечения оси двойной спирали ДНК - внутри нуклеосомы и на входе / выходе. Более точный расчет оценивает райзинг нуклеосомнои ДНК как Wrn ~ -1,7. Расхождение между Wrn и ALkn и выглядит парадоксальной. Одним из решений парадокса надспиральности может быть положительный вклад от изменения Твиста нуклеосомнои ДНК ATwn в общее изменение числа зацеплений (по ровной. 3.2). Это решение, предложенное в свое время Криком и Клугом (Francis Crick, Aaron Klug), сыграло важную роль в развитии молекулярной биологии, но оно не позволяет в полной мере решить парадокс надспиральности. Действительно, хотя ATwn имеет положительное значение (происходит дополнительное закрутки двойной спирали в нуклеосомы, пидпидрозд. 3.1.2), изменение Твиста не является достаточно высокой, чтобы полностью компенсировать Wrn к ALkn = -1. Средняя спиральная периодичность нуклеосомнои ДНК равен 10,2-10,3 П.А. / Виток, то есть, если средняя периодичность свободной ДНК составляет ~ 10,5 П.А. / Виток, то для 147 пар оснований ATwn ~ +0,3 + +0,4, и ALkn остается достаточно далеким от экспериментально полученной величины.

 

Ответ дает конформационная динамика нуклеосомы, которую удается зафиксировать на простой системе - мононуклеосоми, что реконструированная на циркулярной ДНК малого размера (миницикли). Принципиальная схема экспериментального подхода показано на рис. 3.10: нуклеосома реконструируется на миницикли размером 350-360 пар оснований, после чего миницикл обрабатывается топоизомеразой I (при физиологических значений ионной силы и температуры) для максимально возможной релаксации. З \ Lk = Mk "+ \ Lk, '8

Рис. 3.10. Схема эксперимента по нуклеосомы, реконструированными на минициклах ДНК (пояснения в тексте).

Нуклеосома, \ Lk "

Вследствие маленького размера и, соответственно, высокой жесткости, свободные минициклы дают обычно только один топоизомер после релаксации (Lk которого является ближайшим к значению Lk0). Но при наличии нуклеосомы в релаксований смеси присутствуют не менее двух топоизомеры. Это сразу указывает на рост общей пластичности миницикла - вывод неожиданный и несколько контринтуитивний, несмотря на то, что размер свободной петли в составе реконструированной частицы значительно меньше общей контурной длины миницикла.

 

Циркулярная ДНК, содержащий нуклеосому и подвергается релаксации с помощью топоизомеразы, может быть разделена на два топологические домены: ДНК в составе нуклеосомы, структура которой определена взаимодействиями внутри частицы, и свободная петля, структура которого ограничена только на концах. Суммарное значение ALk миницикла состоит из части надспирализации ALkn, снятой нуклеосомы, и надспирализации ALk, оставшейся в петли (рис. 3.10):

 

ALk = ALkn + ALk,

этого релаксованого материала удаляются гистоны, и уровень надспирализации анализируется с помощью электрофореза. Полученные значения ALkn практически совпадают с оценками райзинга для указанных структурных форм: для минициклив, происходящих от плазмиды pBR322, твист ДНК в нуклеосомы равен таковому в растворе (последний в условиях эксперимента соответствует 10,49 П.А. / Виток). Эта ситуация не является общим правилом: на минициклах другого происхождения (т.е. на ДНК других последовательностей) зарегистрированы другие, меньшие по абсолютной величине, значение ALkn, которые указывают на дополнительное закручивание нуклеосомнои ДНК. На минициклах, происходящих от фрагмента а-сателлитной ДНК человека (как и ДНК, использованная в кристаллографических исследованиях нуклеосомы, описанных в разделе 3.1) спиральная периодичность внутри нуклеосомы оценивается в 10,3 П.А. / Виток (против 10,49 п .о. / виток в растворе), а значение ALkn для трех состояний составляют -1,55, -0,79 и -0,47. На ДНК из гена рибосомной РНК 5S морского ежа Lytechinus variegatus соответствующие ALkn равны -1,40, -0,72 и -0,41, а спиральная периодичность в нуклеосомы 10,3 П.А. / Виток против 10,54 П.А . / виток в растворе.

 

Кроме зависимого от последовательности пар оснований полиморфизма нуклеосом по спиральной периодичности, нуклеосомы на минициклах различного происхождения характеризуются разной конформационной динамикой. Преобладающим, что можно было ожидать, есть закрытый негативное состояние, отвечающий канонической структуре нуклеосомы, - его свободная энергия AGn (относительно открытого состояния, для которого принято AGn = 0) варьирует от -0,8 до -1,7 единиц kT. Закрытый позитивное состояние наименее выгодным энергетически, и для некоторых последовательностей он вообще практически недоступным.

 

Таким образом, небольшая по сравнению с энергией тепловых флуктуаций разница свободных энергий между структурными состояниями, собственно, и обеспечивает возможность конформационной равновесия. Это равновесие сдвигается в ту или иную сторону в зависимости от уровня надспирализации, а также модулируется последовательностью ДНК в составе нуклеосомы. Иначе говоря, нуклеосомни структурные состояния играют роль буфера, который снимает часть надспирализации того или иного знака, и эти буферные свойства зависят от последовательности пар оснований нуклеосомнои ДНК.

 

Кроме того, конформационная равновесие зависит от типа гистонов, входящих в состав нуклеосомы. Так, присутствие в нуклеосомы CENP-A вместо обычного гистонов Н3 (см. пидпидрозд. 2.1.3) способствует развертыванию нуклеосомнои ДНК-наиболее вероятной становится открытая форма нуклеосомы. Это объясняется заменой в составе CENP-A остатков Arg в aN-спиралях - ослабляется контакт между ДНК и гистонами на выходе из нуклеосомы, в SHL ± 6,5.

 

Гиперацетилування гистонов также делает открытую форму подавляющим: снижение положительного заряда гистоновых хвостов приводит к росту расталкивания между соседними витками нуклеосомнои суперспираль на концах. Поскольку ацетилирования гистонов всегда положительно коррелирует с транскрипционной активностью, значение открытой формы нуклеосомы ясен: во-первых, развертывание нуклеосомнои ДНК на концах повышает ее доступность к регуляторных белков, во-вторых, такое развертывание дестабилизирует димеры Н2А-Н2В в нуклеосомы - их перенос на промежуточные гистонов акцепторы, которое достаточно активно происходит во время транскрипции, облегчается.

 

Временное удаление димеров оставляет на ДНК тетрасому (рис. 12, цвет. Вст.), Которая также характеризуется немалой конформационной подвижностью: под действием надспирализации того или иного знака тетрасомна суперспираль меняет свою хиральности: более энергетически выгодная ливоспиральна тетрасома (которая соответствует структуре в составе нуклеосомы ) превращается в правоспиральну в составе положительно надспирализованих топоизомерив (рис. 3.12).

 

Правоспиральна тетрасома может легко поглощать часть положительной надспирализации, которая возникает впереди РНК-полимеразы во время транскрипции: для нее также проявляются указанные выше буферные свойства, которые также зависят от последовательности ДНК в составе тетрасомы (разница свободных энергий между двумя состояниями немного варьирует для разных последовательностей) и от гистоновых хвостов, удаление или гиперацетилування которых значительно облегчает переход в правоспиральну конформацию.


Загрузка...
Яндекс.Метрика Google+