Структура ДНК в нуклеосоме. На рис. 3.2 изображен нуклеосомну ДНК и одну из ее симметричных половин. Очевидно, что двойная спираль значительно изогнутой на поверхности октамер гистонов, а общая конфигурация ее оси может быть аппроксимирована идеальной левой суперспираллю с радиусом 41,9 ? и шагом 25,9 ?. Центральные 133 пары оснований такой суперспираль дают 1,67 витка, два участка по 7 пар оснований на входе / выходе просто продолжают ход нуклеосомнои ДНК по прямой. Нуклеосомна суперспираль является почти идеальной. Чтобы выяснить, что означает "почти" в предыдущем предложении, следует сначала остановиться на том, как должен измениться конформация дуплекса для образования идеальной суперспираль.

 

Идеальная спиральная линия характеризуется, в частности, тем, что в каждой точке имеет постоянное значение кривизны, которая однозначно определяется радиусом и шагом спирали. Для ДНК "каждая точка" - это каждый динуклеотидний шаг вдоль двойной спирали, а кривизна является пропорциональной угла изгиба Г между соседними парами оснований, который, в свою очередь, зависит от значений конформационных углов ролла р и тилта т (см. ниже). Вообще для определения конформации двойной спирали необходимо и достаточно для каждого динуклеотидного шага определить шесть конформационных параметров, задающих относительные ориентации соседних пар оснований. К каждой паре ставится в соответствие локальная декартова система координат (рис. 3.3). Две цепи, которым принадлежат основы пары, обозначаются как цепи I и II (произвольно, но за цепь и принимается тот, для которого записывается последовательность нуклеотидов в направлении от 5'-к 3'-конца; абсолютные значения описанных ниже параметров не зависят от нумерации цепей). Ось Y лежит в плоскости пары оснований и направлена от цепи II к цепи I (положительное направление). Перпендикулярна ось Z (нормаль к пары оснований) направлена на следующую (в направлении 5'-3 'по первому цепи) пару оснований. Направление оси X избирается по правилам образования правой декартовой системы координат - желобок, на который она направлена, обозначается как "большой" (для В-формы ДНК этот желобок действительно больше по размерам). Шесть параметров, графически представленных на рис. 3.3, характеризуют конформацию динуклеотидного шага - двух соседних пар оснований:

 

• шифт (shift, Dx) - смещение по оси X - характеризует смещение второй пары основ относительно первой (в порядке нумерации по первому цепи) в направлении одного из желобков (положительное значение соответствует смещению в большой желобок, при изменении нумерации цепей шифт меняет знак) ;

 

• слайд (slide, Dy) - смещение по оси Y - характеризует сдвиг в направлении цукрофосфатного остова (положительное значение соответствует смещению в направлении первого цепи, знак слайда не зависит от нумерации цепей);

 

• райз (rise, Dz) - смещение вдоль оси Z - характеризует расстояние между парами оснований вдоль нормали к первой пары;

 

• тилт (tilt, т) - угол вращения второй пары относительно первой вокруг оси X - характеризует локальный изгиб в направлении цукрофосфатного остова (положительное значение соответствует изгибу в сторону второй цепи, при изменении нумерации цепей тилт меняет знак);

 

• ролл (roll, г) - угол вращения вокруг оси Y - характеризует локальный изгиб двойной спирали в направлении одного из желобков (положительное значение соответствует изгибу в сторону большого желобка, знак ролла не зависит от нумерации цепей);

 

• твист (twist, Q) - угол вращения второй пары вокруг нормали к первой, характеризующий степень спирального закрутки (положительное значение соответствует правой спирали, отрицательное - левой).

 

Среди трех перечисленных конформационных углов твист описывает степень торсионного закрутки двойной спирали, а тилт и ролл

 

- Ее изгиба. Суммарный локальный угол изгиба между двумя парами оснований Г = (т + р), конкретное направление изгиба определяется соотношением между роллом и тилтом. Одна из возможностей реализовать постоянную кривизну заключается в том, чтобы конформационные углы менялись от одного шага к другому периодически и со сдвигом по фазе на четверть периода. Через пиввитка место большого желобка занимает маленький желобок - р =-Г, т = 0, через виток опять имеем максимальный ролл в том же направлении, что на исходном шаге. То есть, реализуется изгиб ДНК в одной плоскости: шаг суперспираль равна нулю. Чтобы суперспираль была левой, точки максимального значения ролла и тилта должны быть разделенными несколько меньшим количеством пар оснований, чем укладывается на полный виток дуплекса. То есть необходимо, чтобы выполнялось условие Qloc> Q (для правой суперспираль-наоборот). Разница Q1oc - Q является при этом пропорционально так называемого геометрического кручения, а величина Qjoc - это угол локального Твиста, который определяет периодичность контактов ДНК с поверхностью октамер гистонов.

 

Итак, для создания идеальной левой суперспираль ДНК необходимо, чтобы ролл и тилт менялись периодически вдоль двойной спирали с одинаковой амплитудой за ровной. (3.1), а также чтобы угол локального Твиста, который определяет эту периодичность, был больше угол Твиста двойной спирали. Реальные конформационные параметры нуклеосомнои ДНК, которые демонстрируют отклонения от такой "идеальной поведения", представлено на рис. 3.4.

 

Во-первых, в соответствии с анизотропией двойной спирали по изгибу (ДНК значительно легче изгибается в сторону желобков, а не цукрофосфатного остова), ролл дает значительно больший вклад в изгиб нуклеосомнои ДНК, чем тилт. Если вариации последнего достаточно беспорядочными, то ролл меняется периодически с высокой амплитудой. При этом изгиб в сторону большого желобка (положительный ролл) существенно больше по сравнению с изгибом в сторону маленького желобка. Кроме того, наблюдаются резкие изгибы в нескольких местах, вероятно связанные с особенностями конкретной последовательности ДНК: например, три резких негативных изгибы в SHL 3,5; 4,5 и 5,5 (рис. 3.4) встречаются на шагах CA / TG . Зато, наблюдается неожиданная периодическая смена слайда: каждый раз, когда большой желобок является ориентированным к поверхности октамер гистонов (целые значения SHL), слайд имеет отрицательные значения (в среднем -0,5 ?): реализуется сдвиг пары оснований в направлении второй цепи, т.е. смещение происходит вдоль оси нуклеосомнои суперспираль в направлении, отвечающем именно левой спирали (справа на рис. 3.3. см.. также рис. 13, 16, цвет. в ст.). Когда к поверхности октамер ориентирован маленький желобок, слайд имеет положительные значения (более чем вдвое больше по абсолютной величине по сравнению с большим желобком): смещение к первому цепи, через пиввитка дуплекса занимает место второй цепи на поверхности ДНК (рис. 16, цвет. в ст.).

 

Таким образом, суперспиральнисть нуклеосомнои ДНК определяется периодическим изменением слайда: если в структуре нуклеосомнои ДНК сохранить все конформационные параметры как они есть, но задать нулевое значение слайда на каждом шагу, реализуется изгиб двойной спирали в одной плоскости (рис. 16, цвет. Вст.) .

 

Что касается двух других конформационных параметров сдвига, шифт варьирует беспорядочно (иногда в довольно широких пределах), отражая определенные нерегулярности в структуре ДНК, зависящие от изгибов (корреляций между различными параметрами) и / или от особенностей последовательности. Райз варьирует в очень узких пределах (среднее значение 3,35 ?), что указывает на сохранение прочных стекинг-взаимодействий между парами оснований в нуклеосомний ДНК. Возвращаясь к угловых параметров, следует особо остановиться на разнице между средним Твистом ДНК в нуклеосомы и в растворе, которая свидетельствует о торсионную деформацию двойной спирали (закручивание) на поверхности октамер гистонов. Это закручивание, так же как и изгиб, обусловлено ДНК-гистоновых взаимодействиями - распределение положительно заряженных сайтов связывания по поверхности октамер требует изменения Твиста для подвода фосфатных остатков под прочные контакты. Кроме того, ограничения на твист накладываются необходимостью сформировать каналы выхода гистоновых хвостов между двумя витками суперспираль (предыдущий пидпидрозд.). Однако, структура нуклеосомы допускает довольно значительные зависящие от последовательности вариации Твиста, как локальные, так и в среднем по нуклеосомний

 

ДНК.

 

До сих пор в этом разделе обсуждалась одна кристаллическая структура нуклеосомы (нуклеосома-147), которая содержит специально сконструированную молекулу ДНК длиной 147 пар оснований: два одинаковых по последовательности инвертированные фрагменты длиной по 73 пары оснований (фрагмент происходит из a-сателлитной - центромерного - ДНК человека) плюс одна пара между ними. То есть, общая последовательность представляет собой палиндром - за исключением центрального нуклеотида, читается одинаково по обеим цепям от 5-к 3'-конца. Таким образом, и последовательность, и структура нуклеосомы характеризуются идеальной симметрией второго порядка. В большинстве кристалогафичних работ по структуры нуклеосомы (за единственным исключением, см.. Ниже), кроме этого фрагмента ДНК, были использованы еще три другие (также происходят из a-сателлита человека) - две длиной по 146 пар оснований, и одна - 145 пар основ. Последовательность ДНК нуклеосомы-145 отличается от нуклеосомы-147 отсутствием двух симметричных пар оснований на концевых участках. Обе последовательности в составе нуклеосом-146 состоят из двух инвертированных повторов по 73 пары оснований каждый. Повторите первый нуклеосомы практически совпадает по последовательности (за исключением одной пары оснований) с повтором, использованным в нуклеосомы-147. Последовательность повтора второй нуклеосомы-146 является другой (использован другой a-сателлитный повтор). Поскольку ось симметрии второго порядка проходит точно через пару основ, обе структуры с 146 парами оснований оказались несколько асимметричными - одна центральная пара и две половины нуклеосомнои ДНК длиной 73 и 72 пары оснований.

 

Асимметрия нуклеосомнои ДНК длиной 146 пар оснований проявляется в том, что более короткая половина вынуждена, ради реализации контактов с поверхностью октамер гистонов (который сохраняет симметрию), немного растянуться (несколько возрастает райз) и увеличить закрутки - суммарное количество витков дуплекса остается такой же, что и для более долгой половины, а количество пар оснований является уменьшенной на 1. В результате средний угол Твиста короткой половины растет (количество пар оснований на виток дуплекса уменьшается). Среднее значение Твиста в двух нуклеосомы-146 соответствует периодичности двойной спирали 10,23 и 10,15 П.А. / Виток. В первой нуклеосомы длиннее и короче половины имеют, соответственно, 10,3 и 10,16 П.А. / Виток, во второй - 10,22 и 10,08 П.А. / Виток.

 

Рост угла твист и растяжения реализуются локально на участках длиной по ~ 12 пар оснований, но в разных местах для двух нуклеосом: в области SHL -2 или -5 (если для длинной половины использовать положительные значения SHL). В длинной половине именно эти места характеризуются меньшими, по сравнению с другими участками, значениями Твист - локальное растяжения / закручивания (stretching / overtwisting) происходит там, где двойная спираль более легко может осуществить торсионную деформацию. Нуклеосома-145 является симметричной, но в ней в обеих половинах наблюдается растяжения / закручивания в SHL ± 2 (на участке длиной ~ 9 пар оснований возрастает райз до 3,63 ? и угол Твиста), и средний угол Твиста соответствует 10,26 п. об. / виток. Таким образом, даже одна и та же последовательность (в нуклеосомы-145 и -147) при образовании нуклеосомы имеет "выбор" - или сохранить минимальное значение Райз и Твиста, или немного растянуться и увеличить закрутки в определенном небольшом сайте.

 

Скорее всего, такой сайт растяжения / закручивания может быть локализован только в двух местах - в SHL ± 2 или ± 5, т.е. в позициях, которые фланкированный однотипными сайтами взаимодействия ДНК с поверхностью гистоновых димеров Н3-Н4 и Н2А-Н2В соответственно (рис. 3.1, 3.2). Эта закономерность была подтверждена в еще одной кристалогафичний работе, где исследовалась структура нуклеосомы, что содержит так называемую "последовательность 601" - синтетическую случайную нуклеотидную последовательность, отобранную как имеющая повышенный потенциал по позиционированию нуклеосомы (раздел 4). Нуклеосома-601 содержит 145 пар оснований ДНК (последовательность является асимметричной), средний угол Твиста соответствует 10,09 П.А. / Виток, растяжения / закручивания реализуется локально на участках по ~ 13 пар оснований в окружении SHL ± 5. Следует заметить, что, несмотря на асимметрию последовательности 601, две половины октамер гистонов в составе нуклеосомы-601 характеризуются симметрией, более того - структура октамер в составе нуклеосом-147 и 601, несмотря на различия в конформации ДНК, очень схожей. Итак, октамер гистонов, сохраняя более или менее жесткую структуру, "требует" от ДНК реализовать контакты с гистонами, а двойная спираль адаптируется под эти контакты, изменяя свою конформацию в определенных пределах в зависимости от своей нуклеотидной последовательности.

 

Спиральная периодичность ДНК для нуклеосом, содержащих другие последовательности, достаточно широко исследовалась с помощью футпринтинга - расщепление ДНК в нуклеосомы ДНКазы I или свободными радикалами. ДНКаза И и свободные ОН ^-радикалы расщепляют только экспозицией зоны каждой цепи ДНК со стороны маленького желобка; участки, связанные с гистонами, остаются защищенными. Мягкая обработка ферментом или радикалами дает, таким образом, набор фрагментов, размер которых является кратным к периодичности экспонирования, что можно проанализировать с помощью электрофореза в денатурирующих условиях. По этим данным периодичность варьирует от 9,9 до 10,5 П.А. / Виток, в среднем равняясь 10,2-10,3 П.А. / Виток.

 

Таким образом, свойства конкретной последовательности, которая входит в состав нуклеосомы, определяют особенности ее конформации - в соответствии с общих представлений о белково-нуклеиновых взаимодействий, происходит тонкая подгонка конформации ДНК под поверхность октамер гистонов. Соответственно, нуклеосомы присущ определенный структурный полиморфизм - именно такой полиморфизм, собственно, и не позволяет получить структурную информацию высокого разрешения на кристаллах нуклеосом, приготовленных прямо из тотального препарата нуклеосом хроматина.


Загрузка...
Яндекс.Метрика Google+