Кроме соматической гибридизации и клеточной селекции есть еще один метод создания in vitro улучшенных форм хозяйственно ценных растений - это генетическая трансформация.

 

Срок трансформация происходит от латинского transformatio-преобразования и означает изменения в геноме и наследственных свойств организма.

 

Генетическая трансформация достигается путем проникновения через каналы клеточной мембраны экзогенной ДНК и взаимодействия последней с клеточным геномом.

 

В отличие от соматической гибридизации и клеточной селекции генетическую трансформацию рассматривают как способ получения более ограниченных и специфических генетических изменений. Во многих случаях отдельная важная в сельскохозяйственном отношении признак, контролируется одним или небольшим количеством генов, может быть изменена путем трансформации, при этом большая часть генома остается без изменений. Технология рекомбинантных ДНК позволяет выделить в чистом виде и в достаточном количестве любой ген и при наличии вектора или иным способом встроить этот ген в состав хромосомной ДНК и добиться его экспрессии. Использование этой технологии делает поиск целенаправленным и значительно расширяет возможности манипулирования генетическим аппаратом при сокращении времени получения новых форм растений.

 

Во всем мире проводятся исследования по определению, выделению, клонированию и вводу в растения генов, отвечающие за устойчивость к холоду, засухе, засолению, т.е. к стрессовым воздействиям окружающей среды, за устойчивость к вредителям, гербицидам и пестицидам, болезней и т.п.. Тот факт, что геном растений изучен хуже, чем геном млекопитающих значительно усложняет такие исследования. На сегодняшний день разработано много подходов к проблеме трансформации, однако с практической точки зрения относительно простой и воспроизводимый метод основан на использовании Agrobacterium tumefaciens.

 

A.tumefaciens - это грунтовая бактерия из семейства Rhizobiaceae, которая способна, поселяясь на раневых поверхностях растений вызывать образование опухолей. Собственно опухолеобразующие агентом является плазмида, часть которой - Т-ДНК (от англ. Transferred DNA), переносится в хромосомы клеток растения (Рис. 7). Плазмида - небольшая кольцевая молекула ДНК, способная к стабильному, не связанного с хромосомами существования и автономной репликации (биосинтез дочерних ДНК). Плазмиды могут встраиваться в хромосомы. Плазмиды локализованы в цитоплазме бактериальных клеток и клетках некоторых дрожжей. После трансформации растительные клетки начинают быстро и неорганизованно расти и синтезировать особые вещества - мнений (производные аминокислот и сахаров), которые бактерии используют в качестве источника азота и углерода. Т.е. образование опухолей сопровождается перестройкой метаболизма клеток, и они начинают синтезировать соединения, необходимые только для бактерий.

 

Ранее предполагали, что A. tumefaciens поражает именно повреждении растения вследствие разрушения клеточной стенки и устранения физического барьера, который усложняет проникновение бактерий в клетку. Однако сегодня считается, что индуктором генетической трансформации в агробактерий является фенольные соединения, ацетосирингон и гидроксиацетосирингон, которые выделяют растения при пораненнях.Плазмиды, которые вызывают опухоли называются Ти-плазмиды (от английского tumor inducing - индуцирующих опухоль). Это кольцевые молекулы ДНК длиной около 200 кб (3-5% от размера хромосомы агробактерии), стабильно сохраняются в Агробактерии при температуре ниже 300С. В бактериальных клетках они реплицируются автономно. Ти-плазмиды различают по типу мнений, который синтезируется. Наиболее часто встречаются плазмиды, кодирующие нопалин или октопин. Считается, что клетка может содержать только один тип плазмиды: либо октопинову, или нопалинову.

 

Генетическая карта Ти-плазмиды полностью не расшифрована. Выяснено только 4 участка: две онкогенные (Т-область и vir-область) и два участка (OR1, CON), которые определяют морфологию опухолей, обеспечивают репликацию плазмид и их конъюгации (рис. 8). Генетические исследования показали, что гены, отвечающие за индукцию опухоли, синтез мнений и угнетение дифференциации, расположены близко друг от друга и входят в состав Т-области плазмиды, которая встраивается в хромосому клетки при инфекции. Т-сегмент имеет длину около 20 кб (10% Ти-плазмиды) и встраивается в различные, очевидно неспецифические, области хромосомы. На Т-области картовано семь генов, которые отвечают за синтез мнений и за угнетение дифференциации клеток. Следует отметить, что все гены, которые отвечают за перенос и интеграцию Т-ДНК, находятся не в Т-ДНК, а в области вирулентности (vir-область). В тех случаях, когда трудно регенерировать целые растения из отдельных клеток, для

 

трансформации используют Agrobacterium rhizogenes, которая вызывает усиленное образование корней при заражении растений. Растения многих видов могут регенерировать из культуры корней, индуцирует эта бактерия. Плазмиды, которые вызывают корнеобразования, называют Ri-плазмиды (от английского root

 

inducing - индуктирующий корни). Корни быстро растут в культуре подобно ткани опухолей и отсутствие бактерий не влияет на их рост. Выяснилось, что клетки корешков также содержат мнений, а их геномы содержат по несколько копий Т-векторами, после трансформации которыми растительные клетки способны регенерировать в здоровые фертильные растения. В настоящее время эти плазмиды рассматривают как перспективные векторы для генетической трансформации растительных клеток.


Загрузка...
Яндекс.Метрика Google+