Изолированные протопласты за то время пока они не образовали клеточную стенку, могут сливаться между собой. Слияние протопластов может быть спонтанным. Это явление, причиной которого может быть сохранение плазмодесм между соседними клетками, происходит очень редко. Длительная инкубация или высокая концентрация ферментной смеси резко уменьшают спонтанное слияния. А потому для стимуляции слияния протопластов предложен ряд методов.

 

Первое сообщение о слиянии изолированных протопластов сделано Кюстер в 1909 году. Для индукции слияния протопластов он испытал несколько веществ и пришел к выводу, что наиболее эффективным является нитрат кальция, хотя частота слияния протопластов была низкой.

 

За последние 20 лет, в качестве индукторов слияния изолированных протопластов испытали: NaNo3, искусственную морскую воду, лизоцим, желатина, высокое рН - высокая концентрация Са + +, антитела, растительный лектин конвалин, ПЭГ, поливиниловый спирт, положительно заряженные синтетические фосфолипиды и другие вещества . В настоящее время наиболее распространенной является методика, когда для индукции слияния протопластов используют растворы с высоким рН (9 - 11) и концентрацией ионов Са + + (100 - 300 мм). При этом протопласты предварительно агглютинирующим с помощью раствора ПЭГ. Используя эту методику можно стимулировать к слиянию 10 - 50% протопластов.

 

Зимерман с сотрудниками в 1981 году разработали физический метод слияния протопластов, в котором как индуктор слияния используют импульсы электрического тока. Протопласты помещают в камеру, где создается неоднородное, переменное электрическое поле. В этих условиях на электродах формируются агрегаты, состоящие из 2 - 3 протопластов, или между электродами формируются "цепочки" из 5 - 6 протопластов (это явление известно как диелектрофорез). К этой системе дополнительно прилагается единичный импульс, который вызывает слияния протопластов в агрегате. Все физические параметры подбираются индивидуально. Слияние происходит при удельной электропроводности среды ниже 10-4 См / см. Это условие удовлетворяет 0,5 М раствор маннита, который относится к неэлектролитов: его удельная электропроводность 1,410-5 См / см.

 

Слияние, индуцированной электрическим током, имеет следующее объяснение: импульс короткой продолжительности вызывает разрушение мембран протопластов, соприкасающихся. Вокруг "дыры" возможен обмен липидными молекулами, образования липидных мостиков приводит к слиянию мембран. Это энергетически более выгоден состояние, чем существование двух поврежденных мембран.

 

Эффективность електрозлиття зависит от возраста растения, происхождения протопластов, их размеров, длины "цепочки", плотности суспензии протопластов, продолжительности действия одиночного импульса.

 

Для автоматизации процедуры електрозлиття изолированных протопластов разработана и уже применяется ряд установок. Например, Electro Cell Manipulator 200 (США), или установка, созданная НПО "Корна" (Россия). Эти установки состоят из генератора напряжения, генератора одиночных импульсов, усилителя мощности, кювет с платиновыми электродами.

 

Итак, во всех методах слияния протопластов на первом этапе происходит их агрегация.

 

Анализ экспериментальных материалов, касающихся структуры и свойств мембран при воздействии индукторов слияния, показывает, что в условиях высокого рН, под действием высоких концентраций Са2 + в растительных протопластов происходит увеличение текучести мембран. ПЭГ не вызывает увеличения текучести мембран, а способствует агрегации протопластов.

 

Разработка способов индукции слияния протопластов вместе с развитием техники культивирования клеток in vitro, что дает возможность получения изолированных протопластов, их культивирования, образования каллуса, а в дальнейшем целого растения, сформировали новый и перспективный метод гибридизации растений-парасексуальными, или соматическую гибридизацию.

 

Соматическая гибридизация - гибридизация растений в обход полового скрещивания, при которой как родительские клетки изолированных протопласты соматических клеток или клетки, культивируемые in vitro.

 

Этот метод позволяет скрещивать филогенетически отдаленные виды растений, которые невозможно скрестить обычным половым путем, получать асимметричные гибриды. В отличие от полового скрещивания, где происходит одностороннее исключение протоплазмы, при соматической гибридизации в образованном гибриде оба партнера имеют относительно ровный цитоплазматический статус. Слияние протопластов способствует объединению двух разных цитоплазмы. В большинстве случаев слияния изолированных протопластов приводит к образованию или гибрида, или цибридов (цитоплазматического гибрида) (рис.6).

 

Цибридных клетка содержит цитоплазму обоих партнеров, а ядро - одного. Образование растений с гибридной цитоплазмой и органеллами обоих партнеров, но с ядром только одного вида возможно в том случае, если после слияния протопластов не происходит соединения ядер и одно ядро дегенерирует. Образование цибридов возможно и в том случае, когда один из протопластов лишен ядра или оно инактивированные путем облучения. Цибридизация позволяет ввести цитоплазматические гены, которые несут признаки ЦМС (цитоплазматической мужской стерильности), устойчивости к некоторым гербицидам и патогенов.

 

Первый неполовой межвидовой гибрид высших растений получен в 1972 г. путем слияния изолированных протопластов двух видов табака: Nicotiana glauca i N. Langsdorfii. Одним из самых интересных соматических гибридов является pomato - гибрид картофеля и томата, полученный в 1978 г. И хотя этот гибрид пока стерильный, а диаметр его плодов не превышает 3 мм, само его существование привлекает внимание к методу прогрессивных селекционеров.

 

На сегодня методами соматической гибридизации получены внутривидовые (дурмана, петунии и др.)., Межвидовые (петунии, моркови, дурмана, картофеля), межродовые (томаты + картофель; арабидопсиса + турнепс; дурман + красавка) и межсемейное гибриды (горох + табак; лук + табак). Однако во многих случаях гибридные растения, полученные таким способом, в определенной мере, ненормальные. Например соматический гибрид между арабидопсиса и турнепсом, который является растением-монстром. Аномалии, возникающие является результатом хромосомной несбалансированности.

 

Особый интерес представляют мижцарственни гибриды, полученные от слияния протопластов растительных и животных клеток. Описаны гибриды между протопласты моркови и человека, табака и человека и другие.


Загрузка...
Яндекс.Метрика Google+