Для выделения мезофильных протопластов используют растения определенного возраста, например, при получении протопластов из листьев табака берут 50 - 60 суточные растения, из листьев бобов - 14 - 18 суточные. Ферментные растворы готовятся непосредственно перед использованием и стерилизуются через бактериальный фильтр (1% Cellulysin - целлюлаз, 0,5% Macerozyme - пектиназу).

 

1. Листья нарезают тонкими полосками (менее 1 мм) и кладут на поверхность ферментного раствора. Ферментацию проводят в чашках Петри или в колбочках объемом 50 мл. Оптимальную температуру и время инкубации необходимо подбирать для каждого конкретного случая.

 

2. Тотальный препарат протопластов после инкубации в ферментном растворе фильтруют через нейлоновую сетку (размер пор - 50 - 100 мкм), чтобы избавиться кусочков ткани и элементов проводящей системы.

 

3. На поверхность ферментного раствора аккуратно наслаивают солевое среду W-5, в состав которого входят NaCl, СаСИ2, KCl и глюкоза.

 

4. Суспензию протопластов центрифугируют при 100g 2 - 3 мин.

 

5. Протопласты, которые флотувалы на грани ферментного раствора и среды W-5, аккуратно отбирают пастеровской пипеткой и переносят в центрифужную пробирку, в которую до 1 мл суспензии протопластов прибавляют 8 - 10 мл солевого среды W-5 и центрифугируют при 80 - 100 g 3 мин .

 

6. Осадок протопластов дважды отмывают в среде W-5 центрифугированием.


Загрузка...
Яндекс.Метрика Google+