Для генетических и физиологических исследований, а также для практического использования в клеточной селекции изолированных клетки. Получение клона-потомства одиночной клетки помогает выяснить причины генетической неоднородности каллусных клеток, поскольку наблюдения в этом случае проводятся на ткани, полученной не из гетерогенного эксплантаты, а из одной клетки. Изолированные клетки также используют как модель для изучения взаимоотношений между клеткой и окружающей средой, клетками растения-хозяина и различными патогенными микроорганизмами и т.п..

 

Получение одноклеточных клонов растений состоит из двух этапов:

 

1. выделения одиночных жизнеспособных клеток;

 

2. создание благоприятных условий для их деления и роста.

 

Для выделения жизнеспособных культур используют следующие методы:

 

1. выращивания каллусных массы и получения из нее суспензии;

 

2. слабо агрегированные суспензии;

 

3. выделение отдельных клеток из тканей целого растения.

 

Получение клеток с суспензионных культур связано с меньшим риском повреждения сравнению с выделением непосредственно из органов растения. Для получения одноклеточной фракции суспензионной культуры иногда достаточно простого отстаивания в колбе течение 15-30 мин. При этом крупные агрегаты оседают на дно колбы, а надосадочную фракция содержит только одинокие клетки или мелкие агрегаты. Если при отстаивании не удается получить одноклеточное фракцию, то применяют ферменты для мацерации, центрифугирования в градиенте сахарозы или фильтрования через сита (нейлоновые или металлические).

 

Трудности культивирования одиночных клеток связаны с тем, что отдельная клетка не делится в тех условиях, в которых хорошо растет каллусных ткань. Для того, чтобы заставить одиночные клетки делиться, разработаны специальные методы:

 

1. метод культуры "няньки";

 

2. метод микрокультуры или висячих капель;

 

3. метод плейтинга.

 

Сюда можно отнести и культуру изолированных протопластов, которая будет рассмотрен далее.

 

Метод культуры "няньки" предложил Джонсон в 1960 году. Функцию "няньки", которая стимулирует деление одиночной клетки, выполняют кусочки каллусных ткани, отделены от нее фильтровальной бумагой. В присутствии "няньки" одиночная клетка делится и дает индивидуальную колонию клеток - клон (Рис. 2).

 

Метод микрокультуры базируется на использовании очень малых объемов богатого питательной среды и представляет собой культивирования одиночных клеток в микрокапли в чашке Купрака объемом 20 мл. Метод предложил академик Глеба Ю.Ю. В микрокапли удобно наблюдать за получением и делением клеток при соматической гибридизации.

 

Метод плейтинга предусматривает смешивание клеток суспензии с расплавленным и охлажденным до 35 ° -40 ° С средой и разлив тонким слоем (1 мм) в чашки Петри. Этот метод был разработан Бергманом в 1960 году. Этот метод используется для получения одноклеточных клонов и оценки жизнеспособности клеток.

 

Использование культуры "няньки", минимального объема среды, в которой культивируется отдельная клетка, связанные с феноменом, который называют

 

"Действие фактора кондиционирования". Несмотря на многочисленные попытки определить химическую природу веществ (или вещества), которые индуцируют деление одиночной клетки и механизм действия фактора кондиционирования, эта проблема остается нерешенной. Исследования показали, что этот фактор химической природы и включает низкомолекулярные вещества (~ 700 Д).


Загрузка...
Яндекс.Метрика Google+