Культура изолированных корней является удобным методом для изучения влияния внешних факторов, компонентов питательной среды (макро-и микроэлементов, углеводов, физиологически активных веществ), токсичных элементов на их рост, для изучения синтетических функций корня, а также механизмов биосинтеза отдельных веществ. Выделительная функция корней, которая проявляется в культуре, может быть использована для изучения процессов взаимовлияния между корнями различных видов растений, корнями и клубеньковыми бактериями, микоризные грибами, бактериями при совместном культивировании.

 

Первые работы по культивированию изолированных корней были проведены Коте и Роббинсом в 1922 году. Длительного культивирования изолированных корней добился Уайт, а предложенное им в 1934 году среду для культивирования изолированных корней используется и сегодня.

 

Относительно небольшое количество видов растений исследована на способность их корней расти в изолированной культуре. Из класса голосеменных всего изучены условия роста изолированных корней некоторых видов сосны. Из других древесных пород в изолированной культуре успешно растут корни шелковицы, акации, ели европейской, березы пушистой, дуба черешчатого. До сих пор не удалось вырастить в непрерывной культуре корни однодольных, за исключением пшеницы и ржи.

 

В изолированной культуре выращивают отрезки кончиков корней проростков, зародышей непроросшими семян, Адвентивная корни, образовались из каллусных культур, участки корневых систем растений. В последнем случае корни небольшого диаметра сначала стерилизуют, а затем переносят в питательную среду. Однако, так как ткани корня легко повреждаются стерилизующие соединениями, то общепринятым способом является получение корней от проростков с простерилизованного семян, выращенных в асептических условиях.

 

Чаще изолированные корни культивируют на жидкой питательной среде в колбах объемом 100 мл, в которые наливают 50 мл среды.

 

Важное значение для нормального роста изолированных корней имеет температурный фактор, поскольку температура влияет на процессы клеточного деления и роста растяжением. Для большинства корней двудольных оптимальная температура в условиях in vitro составляет 25 ° -27 ° С, а для корней голосеменных - 18 ° - 20 ° С.

 

Иногда возникает необходимость длительного сохранения культуры корней без пересадки. В таких случаях ватные пробки культуральных сосудов обертывают тонкой полиэтиленовой пленкой для уменьшения испарения среды и помещают в холодное помещение с температурой 4 ° -5 ° С.

 

Корни томатов и люцерны при этой температуре сохраняли свою жизнеспособность 7-10 месяцев.

 

Как правило изолированные корни выращивают в темноте. Свет влияет на них только во время пересадок. Но в ряде работ показано значительное влияние света различной интенсивности и различного спектрального состава на рост и процессы обмена в корнях. Так, освещение белым светом в опытах с корнями томатов стимулировало рост главного корня и ингибувало рост боковых. Освещение корней способствует синтезу в них ауксина. В опытах с корнями люцерны и горчицы белой установлено, что синий свет сильнее ингибувало рост, чем красное, однако под его влиянием усиливался синтез аскорбиновой кислоты и повышалась активность ИУК-оксидазы. Относительно влияния красного света на формирование и рост боковых корней, то предполагают, что в этот процесс включается фитохромна система тканей корня, которая видоизменяет митотическую деятельность, осуществляемая при участии ИОК.

 

Для количественного учета роста корневых культур используют следующие определения: замеряют общую длину и ежедневный прирост главного корня, количество и общую длину боковых корней, вес сырой и сухого вещества, биомассу корней в одном культуральной сосуде, объем корневой системы, размер клеток экзодермы т.д..

 

Культура изолированных листьев перспективна для изучения продолжительности их жизни, физиологии роста и развития в контролируемых условиях от становления к завершению. Кроме того, сегменты листа используют для изучения действия физиологически активных веществ, механизма перехода клеток к дедиференциации. Культура изолированных листьев используется как метод для размножения некоторых видов растений. Особое значение культура изолированных листьев приобрела в связи с развитием метода выделения изолированных протопластов.

 

Первые жизнеспособные культуры листьев были получены для папоротников. Было обнаружено, что в культуре рост замедлялся, а развитие ускорялся, в результате чего листья были меньших размеров, чем in vivo. Уменьшение размеров листьев, которые культивируются было связано главным образом с уменьшением количества, но не размера клеток, что связано с возможным устранением влияния некоторых веществ, способствующих клеточном деления.

 

На развитие листьев в культуре существенное влияние оказывает содержание сахарозы в среде:

 

- При низких концентрациях формируются малые листья ювенильной морфологии;

 

- При более высоких концентрациях формируются листья взрослого типа с выразительной морфологической сложностью.

 

В зависимости от целей исследований культивировать можно целые листки (для размножения), эксплантаты листьев, листья апикальных почек. Предпочтение следует отдавать младшим листьям или листьям с молодых растений.

 

Эксплантаты листьев большинства видов в условиях in vitro способны к образованию каллуса и дифференциации адвентивных почек, зародышей, корней. Путь, по которому пойдет развитие эксплантаты листа, зависит от соотношения ауксинов и цитокининов в питательной среде.

 

Части цветка культивируют с целью изучения закономерностей их развития, а также влияния факторов питательной среды и других условий, которые индуцируют морфогенез. Как первичные эксплантаты в изолированных условиях можно выращивать целые соцветия, цветочные почки и отдельные органы цветка (цветоножки, лепестки, цветоложе, пестик, чашелистики, пыльца, пыльники). Результаты, полученные при культивировании различных органов цветка показали, что все они обладают способностью к калюсоутворення и морфогенеза.

 

Культура изолированных завязей перспективна для изучения процессов опыления, влияния различных тканей цветка на развитие завязи в плод. Первые исследования развития завязей в изолированной культуре связаны с именем Нича (1949, 1951). Он культивировал цветки томатов, которые опыляли за несколько дней до введения в культуру. Завязи становились заметными через неделю после посадки и постепенно увеличивались. Через 35 дней были красные плоды, которые по вкусу напоминали обычные томаты. Большинство плодов имели жизнеспособное семян, хотя его количество было незначительным. Если цветки изолировали к опылению, то завязи формировались только на среде с ауксином.

 

На сегодняшний день в условиях культуры выращивают ткани плодов цитрусовых (лимона, апельсина, мандарина), яблоки, груши, персика, айвы, авокадо. Перспективным является использование суспензионных культур плодов для изучения гормональной регуляции процессов созревания, биогенеза природных соединений.

 

Заслуживает внимания свойство тканей некоторых плодов накапливать в условиях in vitro крахмал и синтезировать метаболиты вторичного обмена. Так ткань зрелых плодов цитрусовых in vitro способна к синтезу флавоноидов, гликозидов, эфирных масел. Свойство продуцировать некоторые ароматические летучие соединения характерна каллусных и суспензионным культурам яблоки.

 

На сегодня количество видов плодов, культивируют in vitro остается ограниченной и основное внимание сконцентрировано на определении источников питания для индукции пролиферации.

 

Культивирование in vitro пыльцы и пыльников позволяет получать гаплоидные растения и каллусных ткань. Получение гаплоидных растений на искусственной питательной среде из изолированных пыльников и пыльцы называют андрогенезом. Культивирование in vitro пыльцы и пыльников имеет большой интерес для генетики и селекции, так как в гаплоидов проще выявить и отобрать ценные мутации, а с помощью колхицина можно получить полностью гомозиготные диплоидные растения. Кроме этого пыльцевые зерна, которые запрограммированы на образование гамет, в условиях культуры переключаются на процессы, которые присущи вегетативной клетке. Благодаря этому, культура пыльцы и пыльников используется в физиологических и биохимических исследованиях. Интенсивные исследования в этом направлении способствовали тому, что для 247 видов растений, относящихся к 88 видов и 33 семей разработаны приемы получения гаплоидов (методом изолированного пыльцы и пыльников), 40 видов из них экономически важные - пшеница, рис, кукуруза, ячмень, люцерна , лен, перец, апельсин, виноград, яблоня, картофель и другие.

 

В условиях культуры индукция к росту микроспор и образования эмбриоидов может происходить двумя способами:

 

1) прямым эмбриогенеза;

 

2) косвенным путем - через образование каллуса и индуцирования в нем эмбриогенеза.

 

Прямого развития эмбриоидов с пыльцевых зерен достигли в четырех родов из семейства Solanaceae - Datura, Nicotiana, Atropa и Lucium.

 

Для получения гаплоидной ткани рекомендуют использовать пыльники в момент первого митоза или сразу после него. При изоляции пыльников ни в коем случае нельзя их травмировать, это может привести к гибели всего пыльника, и, кроме того, Калюс может образоваться не из пыльцы, а из соматических диплоидных клеток.

 

Важно, чтобы пыльники были взяты из относительно молодых растений, поскольку у старых растений на конец цветения образуются мелкие бутоны, содержащие пыльники с гетерогенной смесью микроспор и много пыльцы с дефектами. При культивировании пыльников табака и белладонны на простом среде без витаминов и гормонов происходит эмбриогенез. А на средах с регуляторами роста индуцируется пролиферация соматических тканей в результате чего образуется смесь каллуса с разным уровнем плоидности.

 

Избавиться конкурирующего роста соматических тканей можно культивируя пыльцу. Этот метод дает возможность избавиться ингибиторов, содержащихся в тканях пыльника. Сложности метода культивирования пыльцевых зерен заключаются в необходимости индуцирования первых делений пыльцы in vitro. Наибольший эффект на этот процесс влияет на отделены от растений бутоны пониженной температурой (5 ° С) в течение 3х дней. Кроме того, установлено, что для первых делений пыльцы при эмбриогенезе необходимо присутствие ауксина.

 

Применение техники культивирования пыльников и пыльцы позволило китайским ученым за короткий срок вывести свыше 80 сортов и линий риса, высокоурожайных (до 75 ц / га), устойчивых к различным патогенных микроорганизмов, с широким спектром адаптивности. С помощью этого же метода в Одессе было получено 20 сортов пшеницы и 2 сорта ячменя. Кроме этого, полученные in vitro гаплоидов можно использовать в работах по генетической инженерии и клеточной селекции. В некоторых случаях для опытов по генетической трансформации удобнее использовать пыльцевые зерна чем протопласты.

 

Культуру зародышей используют для изучения процессов формирования зародыша на материнском растении, выяснения причин и условий клеточного деления, дифференциации и морфогенеза. Известно, что период эмбрионального развития организма характеризуется высокой активностью процессов клеточного деления и дифференциации.

 

На самых ранних этапах эмбриогенеза происходят активные разделения зиготы без дифференциации. На последующих этапах начинается дифференциация. Клетки приобретают способность выполнять определенную функцию, формируется сложный организм. Это неизбежно сопровождается возникновением сложной системы регуляторных механизмов, возникновением коррелятивных связей между ними. В основе сложного процесса дифференциации, морфогенеза, возникновения коррелятивных связей лежит изменение и регуляция активности генов на начальных этапах. Кроме того, процессы эмбриогенеза в нативных условиях испытывают влияния материнского организма. Эту зависимость зародыша от материнского растения можно устранить воспроизведением эмбриогенеза в контролируемых условиях. Учитывая это, метод выращивания изолированных зародышей ранних этапов формирования является единственным из подходов, что позволяет экспериментально исследовать временную, последовательную реализацию генетической информации, действие генов в ранний период индивидуального развития организма.

 

Все исследования по культуре зародышей in vitro следует разделить на две группы.

 

В одних работах в контролируемых условиях выращивали зрелые, в основном сформированы зародыши, в других - зародыши на ранних этапах эмбрионального развития.

 

Исследования по выращиванию зрелых зародышей, в основном, направлены на получение взрослых растений из абортивных зародышей, непохожего в обычных условиях семена, полученного в результате отдаленной гибридизации.

 

С помощью выращивания in vitro зародышей семян, сложно или долго прорастает можно преодолеть период покоя и ускорить получение взрослых растений. Выращивание в контролируемых условиях незрелых зародышей поможет исследовать первичные, элементарные процессы образования биологических структур, клеточного деления и дифференциации, органогенеза, морфогенеза. Особенно важно осуществление и воспроизведения in vitro эмбриогенеза, начиная с первых делений оплодотворенной яйцеклетки. Основная проблема, которая возникает при культивировании незрелых зародышей, связана с поиском путей проведения яйцеклетки к делению.

 

Культура изолированных меристем используется для оздоровления (освобождение от вирусов) и размножения растений. В физиологии и биохимии растений культура in vitro апикальных меристем используется главным образом, в исследованиях морфогенеза.

 

Метод получения безвирусных растений из меристем базируется на наблюдениях Лимассе и Корнуе (1949), которые установили, что содержание вирусов в больном растении уменьшается по направлению к верхушке растения, а собственно меристема может быть совершенно свободна от вирусной инфекции.

 

Меристемы обычно называют ткань верхушки побега размером 0,1 мм - 1 см. Собственно апикальную меристему - конус клеток, активно делятся высотой 0,1 мм и шириной 0,25 мм сложно выделить без повреждения и индуцировать к росту. В связи с этим часто выделяют самую меристему и один или два листовых примордиев. Растительный материал для вычленения меристем целесообразно брать из молодых проростков, вновь почек или молодых побегов. Не стоит использовать меристемы с побегов, которые имеют цветки.

 

На сегодня практические результаты по оздоровлению растений от вирусной инфекции полученные для картофеля, земляники, гвоздики, яблони, черешни, шелковицы, смородины и др.. Наиболее детально разработаны условия культивирования меристем картофеля.

 

Метод культуры ткани меристем успешно используют для ускоренного размножения растений и массового производства посадочного материала сельскохозяйственных растений, а также декоративных растений, например, орхидей.

 

Использование метода культуры меристем для размножения растений приобретает особое значение в случае, когда обычный способ вегетативного размножения является длительным процессом, а исходный материал представляет ценность, как, например, у орхидей. Размножение орхидей делением клубней - это медленный процесс, развитие полноценной растения требует 10 лет, а потому приобретает значение метод размножения орхидей с помощью меристем, культивируемых in vitro (с 1965 года).

 

В орхидей апикальной меристемы не развивается в побег, а формирует протокормы - особые эмбриональные структуры, которые способны к вегетативному размножению. Так, каждый эксплантаты дает минимум 2-3 протокормы через 4-68 недель, в течение 4-5 недель разрастаются. После чего их делят и переносят на свежий среду, где в течение 6-7 недель формируются побеги и корни. Сформированные растения отделяют, а протокормы продолжают клонировать. Период развития от меристемы в пробирочных растеньица составляет примерно 20 недель.

 

Однако следует отметить, что методика вегетативного размножения in vitro с использованием культуры меристем имеет определенный недостаток, связанный с уменьшением генетического разнообразия: поскольку все растения данного вида происходят из одной меристемы, то новые болезни могут стать для них катастрофическими, так как эти растения генетически идентичны (или почти идентичны) друг другу, имеют одинаковую чувствительность патогенных микроорганизмов или паразитов. Поэтому, наряду с развитием техники массового размножения необходимо создавать банки зародышевой плазмы (коллекции семян), для того чтобы сохранить генотипы, которые необходимы для поддержания генетического разнообразия.


Загрузка...
Яндекс.Метрика Google+