Эффективность препаратов антител, полученных при иммунизации животных, меняется от одной партии к другой, поскольку в одних случаях во время проведения иммунизации антитилопродукувальные клетки сильнее стимулируются одними детерминантами определенного антигена, а в других иммунная система активно отвечает на другие эпитопы того же антигена. Это может влиять на способность различных препаратов антител сочетаться с антигенами, поскольку отдельные эпитопы имеют разную эффективность (стимулирующее способность). Поэтому в одной партии поликлональных антител может содержаться мало молекул, направленных против основного эпитопов, и в результате она будет менее эффективной, чем другая. Чтобы повысить специфичность антител, для диагностики часто используют моноклональные антитела. В-лимфоциты (В-клетки), синтезирующие антитела, не могут длительное время культивироваться в культуре in vitro. Решение этой проблемы исследователи видели в создании гибридной клетки. Получив генетическую составляющую от В-клетки, она могла бы вырабатывать антитела, а получив способность к делению от клеток совместного типа - расти в культуре. Было известно, что В-лимфоциты иногда перерождаются и становятся раковыми (миеломная) клетками, приобретая способность к росту в культуре и сохраняя вместе с тем многие свойства В-клеток. Так клетки миеломы, прежде всего те, что не производят антител, стали кандидатами на слияние с антитилопродукувальнимы В-клетками.

 

Первый шаг в процессе получения гибридной клеточной линии, которая производит антитела одной специфичности, заключается во введении мышам антигена - иммунизации. После цикла иммунизации, проведенного в течение нескольких недель, проверяют, произошло развитие у животных иммунного ответа. Если ответ развилась, то у животных берут селезенку, промывают ее, измельчают и слегка встряхивают для высвобождения единичных клеток, среди которых находятся и антитилопродукувальни В-клетки. Клетки селезенки смешивают с суспензией специальных миеломных клеток, дефектных (мутантных) за ферментом гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы (ГГФРТ). Такое суспензию в течение нескольких минут инкубируют в 35% растворе полиэтиленгликоля, а затем переносят в среду, содержащую гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда ГАО). Обработка полиэтиленгликолем способствует слиянию клеток, однако оно происходит редко и в большинстве своем случайным событием. В смеси содержатся клетки миеломы, селезенки, а также гибридные (те, слившиеся) клетки миеломы-селезенки. Однако в среде ГАО растут только гибридные клетки миеломы-селезенки, все другие типы клеток погибают. Клетки селезенки, слившихся вообще не растут в культуре in vitro, а дефектные (мутантные) миеломные клетки ГГФРТ не могут использовать гипоксантин как предшественник в процессе биосинтеза пуриновых оснований гуанина и аденина, без которых невозможен синтез нуклеиновых кислот. Однако у них есть другой естественный путь синтеза пуринов - с участием дигидрофолатредуктазы, поэтому в состав среды и входит аминоптерин, что ингибирует активность этого фермента. Итак, миеломные клетки ГГФРТ не могут синтезировать пурины в среде ГАО и погибают.

 

Клетки селезенки-миеломы, слившихся растут в среде ГАО, поскольку клетки селезенки поставляют функциональный фермент ГГФРТ, предоставляющий гибридомы способности утилизировать экзогенный гипоксантин среды, несмотря на блокирование синтеза пуринов с участием дигидрофолатредуктазы Аминоптерин, и за счет способности клеток миеломы к активному делению. Тимидин нужен для устранения блокировки в синтезе пиримидинов, обусловленного ингибированием дигидрофолатредуктазы. На 10-14-е сутки после слияния клеток в среде ГАО остаются и растут только слиты гибридомы селезенки-миеломы. Их потом вносят в углубление пластиковых микротитровального планшетов и выращивают на полном культуральной среде без ГАО. После проведения слияния и получения гибридомы нужно осуществить идентификацию (скрининг) гибридных клеточных линий, секретирующих специфические антитела к антигену, который использовали для иммунизации. Для этого обычно проводят скрининг культуральных сред, содержащих антитела, которые секретируются, например, иммуноферментным анализом. Чтобы получить линии, которые происходят от одной клетки (клоны), клеточную суспензию из таких углублений разбавляют культуральным средой и высевают в другие углубления. После культивирования полученных клонов среды снова тестируют, определяя, какая из клеточных линий (гибридом) продуцирует моноклональные антитела (МКАТ), распознающие антиген-мишень. В том случае, когда получают более одну специфическую гибрида, проводят дальнейшие исследования, позволяющие определить, направлены антитела, которые вырабатываются различными клонами, против одной и той же антигенной детерминанты. Каждый клон, продуцирующий моноклональные антитела, можно поддерживать в культуре практически бесконечно. Кроме того, образцы можно заморозить в жидком азоте и использовать их в дальнейшем как источник клеток. Иногда используют культивирования гибридом в организме мышей. Для этого гибрида вводят в брюшную полость мышей совместной генетической линии после предварительного подавления их иммунной системы, например, введением минерального масла. Гибридомы (собственно злокачественная опухоль) приживается в брюшной полости мыши, начинает размножаться и синтезировать значительное количество антител, которые можно выделить из асцитической жидкости.

 

Причудливые молекулы (гуманизированные ан | титила). Полученные гибридомной технологии МКАТ имеют абсолютно одинаковую специфичность, принадлежащих к одному классу, подклассу иммуноглобулинов и практически стандартными препаратами, характеристики которых не зависят от условий содержания животных, индивидуальных особенностей и т.д.. В связи с этим сейчас МКАТ нашли широкое применение для выделения высокоочищенных препаратов некоторых веществ, как компоненты диагностических препаратов, новые типы вакцин, иммунотерапевтические средства.

 

Так, многие МКАТ были тестированы на способность подавлять отторжение пересаженных тканей и влиять на ход аутоиммунных болезней. Однако возникла проблема получения МКАТ, пригодных для терапии людей. Поскольку по своей природе МКАТ является преимущественно мышиными, это значительно ограничивает их использование в качестве терапевтических препаратов из-за их иммуногенность для человека. При введении мышиных МКАТ в организме человека образуются антитела против них. Это не только приводит к блокированию действия антител мыши и может обусловить появление аллергической реакции и даже анафилактического шока.

 

Избежать этих проблем удалось лишь с использованием современных методов генной инженерии. С помощью манипуляций с генами было получено причудливые молекулы иммуноглобулинов - гуманизированные антитела. При создании таких антител учитывают иммуногенность отдельных участков молекулы иммуноглобулина и их роль в осуществлении эффекторных функций. Прежде было заменено Fc-фрагмент мышиных МКАТ соответствующим участком антитела человека. Это связано с тем, что Fc-фрагмент мышиных МКАТ при введении их в организм человека выполняет роль эффектора иммунного ответа недостаточной мере и именно он в основном отвечает за индуцирования синтеза антител против мышиных антител.

 

Для уменьшения иммуногенности методами генной инженерии провели также замену последовательностей ДНК, кодирующих Fv-участка L-и Н-цепей иммуноглобулина человека на аналогичные участки мышиных специфических МКАТ. Такие причудливые молекулы были протестированы как иммунотерапевтические препараты, например, при лечении рака толстой кишки. Еще более перспективным направлением получения гуманизированные антител является создание таких человеческих антител, в которых только гипервариабельные (CDR) участки заменены соответствующими фрагментами МКАТ мышей и крыс. Такие антитела могут быть перспективными иммунотерапевтические средствами, поскольку могут иметь любую специфичность при сохранении практически полностью человеческого происхождения. С использованием современных методов направленного мутагенеза можно заменить и некоторые аминокислоты из каркасных участков, определенной степени участвуют в формировании активного центра рядом с гипервариабельные области.

 

На сегодня известно более 50 различных МКАТ, подобных антител человека. Такая довольно небольшое их количество связано с тем, что описаны технологии - эффективные и универсальные, однако чрезвычайно затратными как по времени, так и по стоимости. Поэтому все актуальнее становятся новые технологии получения функциональных антител в культуре рекомбинантных клеток Е. coli.


Загрузка...
Яндекс.Метрика Google+