Традиционно методы лабораторных иммунологических исследований разделяют на методы оценки природного и клеточного и гуморального антигенспецифичного иммунитета. Различают разные уровни иммунологического обследования. Определения количественных показателей и функциональной активности иммунной системы в норме и при патологии согласно рекомендациям НИИ иммунологии (Р. В. Петров и соавт.) Проводят по двухэтапным принципу оценки иммунного статуса. На первом этапе выявляют первичные дефекты иммунитета с помощью ориентировочных тестов, к которым относятся: определение Т-и В-лимфоцитов в крови, исследования концентрации сывороточных иммуноглобулинов A, G, М;

 

оценки фагоцитарной активности клеток.

 

На втором этапе применяют аналитические тесты. К ним относятся все тесты, позволяющие оценить функциональную активность Т-и В-лимфоцитов, НК-клеток, фагоцитов. Существуют другие классификации методов оценки иммунного статуса. Методы иммунодиагностики делятся на ориентировочные и уточняющие. Первые используют для фиксации нарушений в иммунной системе, вторые - для определения механизмов их реализации с целью дальнейшей иммунокоррекции. Для оценки иммунного статуса определяют общее число лимфоцитов, их популяций, исследуют функциональное состояние Т-и В-клеточных звеньев иммунитета и системы фагоцитов.

 

Оценка функциональной активности Т-клеточного звена иммунитета. Ориентировочные методы:

 

определения процентного и абсолютного числа зрелых Т-лимфоцитов - CD3 и двух основных субпопуляций - хелперов CD4 и киллеров / супрессоров CD8, исследования ответа Т-лимфоцитов на ФГА, Кон А, митоген лаконоса в реакции бластной трансформации лимфоцитов (РБТЛ). Уточняющие методы: определение активационных маркеров CD25 и ^ А II на Т-лимфоцитах, исследования продуцирования цитокинов - у-интерферона, фактора некроза опухолей, интерлейкина-1, -2, -4, -5, -6 и других in vivo или in vitro , изучение пролиферативного ответа в РБТЛ специфический антиген; исследования интенсивности апоптоза Т-лимфоцитов методом определения числа CD95, определение супрессорной активности лимфоцитов: спонтанной и Кон А-индуцированной. Оценка функциональной активности В-клеточного звена иммунитета. Ориентировочные методы: установление процентной и абсолютного количества В-лимфоцитов CD20 или CD19, CD22, определение уровня продуцирования иммуноглобулинов А, М, G, Е в сыворотке крови, определение циркулирующих в крови иммунных комплексов, исследования ответы в РБТЛ В-клеточный митоген (ЛПЦ Е. соии или S. typhimurium).

 

Уточняющие методы: определение уровня продуцирования специфических иммуноглобулинов, определение выработки ИЛ-6 in vivo, in vitro, определение концентрации секреторного иммуноглобулина. Оценка функциональной активности системы фагоцитов. Ориентировочные методы: определение абсоютного числа нейтрофилов, моноцитов, исследования интенсивности фагоцитоза, фагоцитарного числа и индекса, исследования бактерицидной активности фагоцитов.

 

Уточняющие тесты: исследования итенсивности хемотаксиса (миграции) фагоцитов (спонтанного и индуцированного) определение количества (в процентах) фагоцитарных клеток и средней способности фагоцитов к поглощению, исследования розпластування макрофагов и агрегирования, адгезионной способности нейтрофилов к пластику и оценки числа клеток с адгезионными молекулами CD11 / CD18 на мембране.

 

Существует несколько методов, позволяющих выделить лимфоциты или их отдельные субпопуляции из исследуемого образца: центрифугирования в градиенте плотности, розеткообразования, Пенинг («просеивания» сквозь основу) и магнитное разделение.

 

Определение количества Т-лимфоцитов. Исследование проводят с помощью проточной цитофлуорометрии, иммунофлюоресценции, иммуногистохимических методов, а также лимфоцитотоксичного теста. Для этого нужны МКАТ к дифференцировочные антигены Т-лимфоцитов. За поверхностными антигенными маркерами определяют популяцию и субпопуляции клеток, стадию их дифференцировки и активации. Специфическими антигенными детерминантами для Т-лимфоцитов является: CD3, CD4 (маркер Т-хелперов), CD8 (маркер Т-киллеров) и др.. Определяют также «наивные» Т-клетки и клетки памяти (соответственно CD45RA и CD45RO). Иногда исследуют субпопуляции хелперных клеток - индукторов хелперов (CD4 CD29) и индукторов регуляторных клеток (CD4 cD45RO) и субпопуляции от8 клеток - прекилерив (CD8 CD11b) и предшественников (CD8 Leu7).

 

Определение количества В-лимфоцитов. Методы основаны на наличии на поверхности В-лимфоцитов рецепторов для Fc-фратента иммуноглобулинов, для третьего компонента (С3), для мышиных эритроцитов и иммуноглобулинового детерминант. Важнейшими поверхностными маркерами В-лимфоцитов является МКАТ-рецепторы CD19, CD20, CD22, которые определяют с помощью МКАТ методом проточной цитометрии. Определение В-клеток и степени их зрелости важно при первичных гуморальных иммунодефицитах, когда нужно различить агаммаглобулинемия с В-клетками и без них.

 

Определение количества нулевых лимфоцитов. В периферической крови содержатся так называемые нулевые лимфоциты - клетки, которые не относятся к Т-и В-лимфоцитов, поскольку не антигенных рецепторов или имеют блокированы рецепторы. Возможно, это незрелые лимфоциты или старые клетки, которые потеряли рецепторы, или клетки, поврежденные токсинами, иммунодепрессантами. Следует отметить, что 70% людей имеют 8 - 25% нулевых лимфоцитов. При многих заболеваниях число таких клеток возрастает вследствие повреждения клеток или циркуляции незрелых или дефектных клеток. Определения их количества проводят, подсчитывая долю Т-и В-лимфоцитов в общем содержании лимфоцитов. Количественное определение иммуноглобулинов. Наибольшее распространение получил метод Manchini et al. (1965), основой которого является принцип радиальной имунодифузии в геле, содержащий моноспецифических сыворотку против иммуноглобулинов. Твердофазный иммуноферментный анализ, который также является широкоупотребляемой вследствие высокой чувствительности, используется для определения в сыворотке минорных иммуноглобулинов IgD и IgE, а также классов и субклассов других иммуноглобулинов. Определение уровня циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в сыворотке крови. ЦИК является результатом компенсаторной реакции антителообразования, направленной на элиминацию антигенов, и может провоцировать некоторые патологии: ревматизм, системная красная волчанка, артрит и др.. Определение комплексов проводят методом спектрофотометрии сыворотки крови, обработанной полиэтиленгликолем (М = 6000).

 

Методы оценки фагоцитарной активности клеток. Исследуют нейтрофилы периферической крови, бронхоальвеолярном и перитонеальные макрофаги. Проводят комплексное исследование функциональной активности фагоцитарных клеток, что позволяет тестировать параметры, изменение которых может свидетельствовать о нарушении толерантности к инфекции. По адгезию фагоцитов к объекту фагоцитоза соответствуют поверхностные рецепторы - селектина и интегринов (CD18, CD11a, CD11b, СD11c, CD62L, CD62E), которые определяют с помощью МКАТ методом иммунофлюоресценции. Поглотительную способность клеток оценивают по фагоцитарной активностью и фагоцитарного индекса. Она нарушается при некоторых острых и хронических инфекционных заболеваниях, аутоиммунных процессах, иммунодефицитных состояниях.

 

Определение бактерицидной активности фагоцитарных клеток. Тест восстановления нитросиним тетразолия (НСТ-тест) отражает степень активации кисневозалежних механизмов бактерицидной активности фагоцитарных клеток, в основе которых лежит активация НАДФ-Н2-оксидазы и гексозомонофосфатного шунта. В результате реакции окисления образуются активные формы кислорода, которые имеют высокую микробоцидну активность; появление определенной формы является показателем функциональной активности фагоцитарных клеток. Метод основан на восстановлении поглощенного фагоцитом растворимого красителя нитросиним тетразолия до нерастворимого диформазану под влиянием супероксиданион, который образуется в НАДФ-Н-Оксидазный реакции. Другим методом оценки респираторного взрыва в фагоцитах является измерение спонтанной и индуцированной хемилюминесценции. НСТ-тест может быть также измерен с помощью проточного цитометр.

 

Определение активности естественных киллеров (НК) осуществляют различными методами. Киллерную активность НК-клеток определяют колориметрическим методом (Н.А. Кузнецова, 1991) за й лизуваты клетки-мишени фибробластов мышей линии L929, обработанных нейтральным красным. Активность НК-клеток можно оценивать, используя клетки-мишени из советов меткой, и с помощью капиллярного теста, информативность которого возрастает при в подсчет количества лимфоцитов с CD16-маркером. В первом случае фу активность НК-клеток определяют по клитиноопосередкованим цитолиз за выходом Сг. Принцип капиллярного теста заключается в совместном культивировании клеток, исследуемых таи клеток-мишеней в плоском капилляре с трипановым синим. После инкубации подсчитывают окрашенные клетки-мишени, их количество соответствует проценту спонтанной цитотоксичности. Активность естественных киллеров у доноров составляет 10 - 25%. Для выявления НК-клеток применяют цитофлуорометричний метод определения ОТ56-клеток и экспрессии CD56 и CD3, CD56 и CD57, CD56 и CD16. Классический фенотип НК-клеток - CD56CD57. Во фракцию естественных киллеров, которые одновременно обладают активностью К-киллеров (эффекторов антигилозалежнои клеточной цитотоксичности), входят клетки с фенотипом CD56CD16. Клетки с мембранным фенотипом CD3 и CD16/56 принадлежат к разновидности Т-лимфоцитов с активностью неспецифических киллеров (НК-клетки).

 

Определение активности системы комплемента. Общее ее оценка производится, как правило,, методом иммунного гемолиза. Определяют С3-компонент комплемента с помощью стандартной преципитувальнои моноспецифических антисыворотки. Сейчас различные компоненты и индивидуальные факторы комплемента определяют иммуноферментным методом с помощью моноклональных антител. Определение HLA-антигенов лимфоцитов. Продукты главного комплекса гистосовместимости (МНС) у людей входят в систему лейкоцитарных антигенов HLA. Определяют HLA-антигены с помощью МКАТ методом проточной цитометрии или иммунофлюоресценции, полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая позволяет выявить особенности, недоступные при традиционном серотипирования. Важным связь между антигенными маркерами человека и развитием тех или иных заболеваний. Например, здоровые особи, которые имеют HLA-антиген DR3, отличаются пониженной активностью клеток макрофагальной системы, пониженной способностью продуцировать ИЛ-1, замедленной деградацией антигенов, замедленным выведением из организма комплексов антиген - антитело, снижением способности лимфоцитов к стимуляции митогенами.

 

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) используется для определения малых количеств вирусных и микробных инфекционных агентов, ее модификации применяют для иммунологического анализа и при анализе вариабельности генов Т-и B-клеточных рецепторов, а также для типирования генов HLA. ПЦР - это циклы синтеза (амплификации) специфического участка ДНК-мишени при наличии термостабильной ДНК-полимеразы, дезоксинуклеозидтрифосфатів (дНТФ), соответствующего солевого буфера и олигонуклеотидных праймеирив, определяющие границы участка, амплифицируемого. За 25 - 40 циклов получают фрагмент ДНК, ограниченный парой выбранных праймеров, достаточный для его определения с помощью электрофореза.

 

Для функционального тестирования Т-и В-лШФоцитив обычно используют реакцию бластной трансформации и миграции клеток, определяют количество антител и цитокинов.

 

Реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) дает возможность определить способность клеток к активации синтеза ДНК при наличии митогенов. Бласты, образующиеся способны к дальнейшей пролиферации и дифференцировки. При митогенного стимулирование с помощью микроскопии регистрируются бласты или радиометричне3оцинюеться пролиферативная способность клеток с включением одного из предшественников ДНК - Н-тимидина. Как Т-клеточные митогены используют фитогемаглютинин (ФГА) или конконавалин А (Кон А), а как B-клеточный митоген - бактериальный липополицукрид Е. соии или S thyphimurium. Модель индуцирования тимусзалежнои гуморального ответа, осуществляемой В-лимфоцитами с участием Т-хелперов, можно тестировать по способности к ответу на митоген лаконоса.

 

Реакция торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) характеризует функциональное состояние Т-системы

 

иммунитета. Метод основан на способности с или митогенами выделять лимфокины, что способствует выявлению цитокинов применяют также имуноф

 

Реакцию бляшкоутворення, или метод локаль В-клеток, продуцирующих IgM-и IgG-антитела. антигенспецифични IgM-антитела, а косвенным гемолитическую действие IgG-антител IgM-антисыворотки,,,, Определение продуцирования цитокинов. Растворимые медиаторы, или цитокины, определяют как множество различных биологически активных молекул, секретируемых клетками. Активность ИЛ-1 определяют традиционными методами усиления пролиферации в культурах клеток при наличии митогены. Для этого используют методы иммуноферментного определения цитокинов в сыворотке крови и других биологических жидкостях. С помощью этих методов можно определить уровень продуцирования цитокинов и способность клеток производить их, кроме того, они дают возможность сопоставлять активность двух типов хелперов - Тх1 и Тх2, что способствует выбору тактики иммуномодулирующее воздействий. Оценка выработки интерферона осуществляют с защитой клеток от действия вируса микрометодом, используя как клетки-мишени фибробласты мышей линии L929 (Ф.И. Ершов, 1996). Уровень фактора некроза опухолей (ФНО) в сыворотке определяют калориметрическим методом (Е.А. Панютич и соавт., 1992), оценивая тумороцидну действие ФНО на клетки-мишени - фибробласты мышей линии L929. Перерасчет цитотоксического индекса (ЦИ), выраженного в процентах, в международные единицы (МО) осуществляют, определяя ЭТИ стандартного раствора рифналину с содержанием ФНО 100 МЕ / мл. Оценка антигенспецифичнои иммунного ответа. Иммунологические методы, основанные на взаимодействии антигена с антителом (серологические реакции, иммунохимический анализ), широко применяют для диагностики. Используя эти реакции, можно определить наличие антител к определенным инфекционных агентов в сыворотке или выявить микроорганизмы в патологическом материале. Высокая специфичность антител позволяет идентифицировать, выделять или количественно определять исследуемый антиген. Существует много методов оценки антигенспецифичнои иммунного ответа. Взаимодействие антигена с антителом вызывает различные последствия, а именно - преципитацию растворимых антигенов, агглютинацию корпускулярных антигенов, нейтрализацию токсинов и вирусов, активацию комплемента. Иммунограмма позволяет точнее оценить функциональное состояние и характер патологических изменений иммунной системы. Одновременно оценивают показатели гемо-и иммунограммы. Количественная характеристика клеток, следует из иммунограммы, вместе с функциональными показателями предоставляет информацию о возможностях иммунной реакции организма.

 

Для оценки состояния Т-клеточного цепи иммунитета используют данные о наличии относительного или абсолютного Т-клеточного ИДС хелперных или цитотоксического / регуляторного типа. Каждый из них может иметь гипо-или гипервариант. Например, при снижении общего количества Т-лимфоцитов за счет ОТК-при абсолютного количества ОТ8-лимфоцитов делают вывод о наличии Т-клеточного ИДС хелперных типа относительного гиперцитотоксичного / регуляторного варианта. Это характерно для многих хронических и рецидивирующих инфекций. Вторичный Т-клеточный ИСС цитотоксического / регуляторного (снижение числа CD8-лимфоцитов) типа абсолютного (или относительного) гиперхелперного варианта характерен для многих аллергических и аутоиммунных заболеваний, особенно в сочетании с признаками активации B-клеточного цепи иммунитета (увеличение числа CD22-лимфоцитlв, гипергаммаглобулинемия , повышение уровня ЦИКив). При абсолютном лимфоцитозе, обусловленном Т-и B-клетками, делают вывод о смешанный Т-клеточный ИДС.


Загрузка...
Яндекс.Метрика Google+