Во время дифференцировки В-клеток происходит реаранжування генов иммуноглобулинов. Для синтеза молекулы иммуноглобулина формируется функциональный ген каждой цепи после транслокации определенного генного сегмента V к соответствующему С-сегмента. Этот процесс осуществляется в результате переноса и присоединения VK-или Vi-сегментов в J-сегментов, a Уи-сегментов - до предварительно объединенных DJ-ceгмент. Образование различных комбинаций VJ-или VJ-сегментов и Vh DJ-сегментов приводит к созданию функциональных генов, кодирующих варибельни домены в соответствии легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов. При этом место соединения различных генных сегментов кодирует третий гипервариабельную участок V-домена каждой цепи иммуноглобулинов. Считают, что любой Vk-сегмент может рекомбинировать с любым JK-сегментом, Vi-сегмент - с любым Ji-сегментом, а любой VH-сегмент - с любым предварительно объединенным DhJh-сегментом (см. рис. 64). В процессе развития В-клеток сначала перестраиваются гены тяжелой цепи иммуноглобулинов. При непродуктивности перестройки генов на одной хромосоме включается перестройка генов на другой. Интересно, что первый этап перестройки, а именно DJ-рекомбинация, происходит параллельно в обеих хромосомах. Далее этот процесс в одной хромосоме останавливается, «ожидая своего часа». В норме клетка имеет экспрессировать только один тип функционально перестроенных генов тяжелого и легкого цепей. Это явление называют аллельными исключением генов иммуноглобулинов. Биологический смысл аллельных исключения сводится к тому, чтобы каждый лимфоидная клетка несла рецепторы только одной специфичности. Природа аллельных исключения долго оставалась неизвестной. Сейчас считается, что, возможно, аллельные исключения генов иммуноглобулинов можно объяснить механическими препятствиями для одновременной деконденсация хроматина двух гомологичных хромосом, которое является необходимым условием протекания реаранжування (в норме происходит перестройка генов лишь одного из пары гомологичных хромосом).

 

После удачной перестройки генов тяжелой цепи начинается перестройка генов легкого к-цепи на одной из родительских хромосом. Аналогично, если такая рекомбинация не удалось, происходит рекомбинация генов к-цепи в другой гомологичной хромосоме. Последними к рекомбинации привлекаются гены 1-цепи. Это происходит только в случае, если не произошло успешной рекомбинации генов к-цепи. Если любая рекомбинация не формирует функциональный ген тяжелого или легкого цепей с правильными рамками считывания, то клетка погибает путем апоптоза. Молекулярные механизмы соединения V-и J-сегментов генов легких цепей или V-, D-, J-генных сегментов тяжелых цепей могут быть обусловлены внутришньохромосомнимы делециями. Процесс объединения генных сегментов обеспечивается наличием на краях каждого сегмента необходимых специфических последовательностей нуклеотидов, что приводит к их рекомбинации.

 

Молекулярные механизмы перестроек генов антител и ВКР. И. Кебат (Е. Kabat, 1980) высказал гипотезу, согласно которой реорганизация генов иммуноглобулинов обусловлена определенными мини-последовательностями, которые размещены по краям сегментов, рекомбинируют. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что реорганизация генов осуществляется преимущественно за счет консервативных маленьких полиндромних повторов, представленных двумя небольшими блоками нуклеотидов с 7 и 9 пар оснований (гептамер и нонамер), которые размещены на 3 '-конце V-еегментив, и такими же инвертированными блоками (нонамер и гептамер) 9 и 7 нуклеотидов на 5'-конце J-сегментов. Гептамер и нонамер разделены участками постоянной длины, которые называют с  шсшаш состоящие из 11 - 12 и 22 - 24 пар нуклеотидов. Такая рекомбинация может происходить по правилу, которое получило название «правило 11/23», то есть в рекомбинацию вступают лишь те гептамер и нонамер, которые разделены спейсерами разной длины. Рекомбинацию обусловливают ферменты рекомбиназы RAG1 и RAG2, которые являются продуктами генов ragl и rag2 (от англ. Recombination activiry genes), которые активируются лишь при созревании лимфоцитов (как Т-, так и В-клеток). Фактически V-, D-и J-генные сегменты напоминают транспозоны, поскольку могут перемещаться в пределах геномной ДНК под действием RAG-рекомбиназ. Сегменты генов, которые вступают в рекомбинацию, на своих концах содержат спейсер разной длины. Так, эмбриональные Vk-гены на 3'-концах содержат блок со спейсерами с 11 - 12 пар нуклеотидов, а на 5-концах J-генов находится спейсер с 22-24 пар нуклеотидов (рис. 65). Фланкувальни последовательности, окружающие V-, D-и J-генные сегменты, называют RSS-последовательностями (от англ. Recombination signal sequences). В процессе созревания лимфоцитов ДНК этих соматических клеток реорганизуется, после чего V-сегменты генов объединяются с J-и D-сегментами, но между ними и С-сегментами остается большой интрон. Транскрибируется единственный VJC-ген, а «ненужная» участок РНК между VJ и С-сегментами вырезается и удаляется при сплайсинга пре-мРНК. Сплайсинг осуществляется на уровне пре-мРНК, в которой VJ-С-генные сегменты соединяются напрямую. После синтеза белка удаляется его N-конечная лидерные последовательность, которая является продуктом L-генного сегмента.

 

Антигеннезалежна перестройка генов иммуноглобулинов происходит при развитии В-клеток в первичных лимфоидных органах (костном мозге), а антигензалежна - во вторичных. Антигеннезалежна перестройка приводит к формированию функциональных IgM-и IgD-рецепторов наивных В-клеток. После стимуляции антигеном происходит переключение синтеза с мембранной на секреторную форму IgM или переключение синтеза на другие классы антител. Кроме того, переключение классов антител сопровождается процессами созревания аффинности активных центров антител. Созревания аффинности обусловлено соматическим мутагенезом и отбором наиболее аффинных рецепторов. Соматические гипермутации в генах иммуноглобулинов. Сейчас считается, что создание разнообразия антител обеспечивается не только значительным количеством различных генных сегментов V, D, J и их комбинаторикой, но и может быть результатом точечных соматических мутаций и «ошибок» при VDJ-рекомбинаций.

 

В 70-80-х годах XX в. во многих лабораториях мира было проведено сравнение первичной структуры генов зрелых В-лимфоцитов, кодирующих иммуноглобулины, с соответствующими генетическими сегментами, содержащихся в геноме клеток. Доказано, что наряду с последовательностями, находящихся в геноме клеток, в генах зрелых В-лимфоцитов также последовательности, обусловленные соматическими мутациями V-сегментов и ошибками, которые возникают во время рекомбинаций VDJ генных сегментов.

 

Роль соматических мутаций в генах иммуноглобулинов впервые показали М.Вайгерт и соавт. (1970) при сравнении аминокислотных последовательностей легких X-цепей, продуцируемых миеломной клеткой одной инбредных линий мышей. В 12 из 18 исследуемых миеломных белков Х-цепи были идентичными, а у 6 - было обнаружено замены одной, двух и четырех аминокислот в гипервариабельных участках. Позже Брек и Бернард (1977) показали, что в эмбриональном геноме мышей этой инбредных линий самом деле есть только один V-ген Х-цепей. Он кодирует именно такие цепи, М. Вайгерт обнаружил в 12 миеломных белках. Таким образом было доказано, что другие 6 вариантов миеломных белков возникли вследствие соматических мутаций. Соматические мутации практически не происходят в участках, кодирующих стали участка иммуноглобулинового цепей, а касаются обычно гипервариабельных участков.

 

Соматические мутации выявлены не только в генах, кодирующих VH-домены миеломных белков, но и в генах гибридомных белков, например тех, кодирующих антитела против субстанции клеточных стенок многих бактерий - фосфорилхолину. Мутации возникают как в экзонах, так и в интроны, однако чаще происходят в первой и второй гипервариабельных участках (CDRi и CDR2). Следовательно, можно предположить, что в геноме должен быть специальный механизм, который обеспечивает гипермутабельнисть CDR-участков. Определенные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что процессы гипермутагенезу находятся в коррелятивной зависимости от переключения синтеза тяжелых цепей с д-цепи на другие классы иммуноглобулинов. В зрелых наивных В-клетках, в которых активируются гены RAG1 и RAG2, процессы переключения классов иммуноглобулинов, а также созревание аффинности иммуноглобулинового рецепторов В-клеток не происходят. Процессы соматического гипермутагенезу также зависят от фермен - индуцированной активацией дезаминазы иитидину (A1CD. от англ. Activation-induced cytidine deaminase). Считают, что этот фермент вносит изменения в определенные участки ДНК, которые затем репаруються с ошибками. Это и приводит к повышению изменчивости определенных участков ДНК, кодирующих вариабельные домены иммуноглобулинов.

 

Сейчас появляются данные, что, вероятно, процесс гипермутагенезу происходит сложнее: дезаминазы цитидина модифицирует определенную РНК, которая приобретает после этого ендонуклеазнои каталитической активности и разрезает геномной ДНК в нескольких местах. При репарации разрывов происходит внесение определенных изменений в структуру ДНК. Что именно приводит специфичность ошибок при гипермутагенезу, окончательно еще не выяснено, однако считают, что у точек, в которых происходят мутации, есть определенные сигнальные последовательности нуклеотидов в геномной ДНК. Недавно было выяснено, что наиболее «уязвимыми» для гипермутаций собой последовательности нуклеотидов определенного образца: A (G)-GC (T)-A (T). «Ошибки» при рекомбинации. При рекомбинации разнообразие активных центров антител существенно увеличивается вследствие «ошибок» при объединении V-генов с соответствующими D-и J-сегментами. Поскольку места 3 соединение VD-. DJ-и В  -    ггмгн   е точно не детерминированы. они могут смещаться в часть 5-и 3'-участков «соседних» гещтишш сегментов. Кроме того, при объединении V-сегментов с соответствующими D-и J-сегментами могут возникать вставки дополнительных нуклеотидов между сегментами объединяются, а также потери нуклеотидов через активность определенных екзонуклеаз. Если при этом не нарушается «рамка считывания» для константной части цепи, то возникает дополнительная вариабельность в третьей гипервариабельные области V-доменов. При этом D-сегмента в сложившемся гене тяжелой цепи иммуноглобулинов потенциально способны считываться во всех трех возможных рамках считывания, что также повышает вариабельность cDR3-региона.

 

Все продукты генов тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов имеют иммуноглобулиновый тип укладки V-доменов. Каркасные последовательности формируют антипараллельными ?-складчатые структуры, между которыми образуются вариабельны петли. Именно в зоне этих петель и наблюдается наибольшая частота аминокислотных замен, обусловленных соматическими мутациями и ошибками при рекомбинаций.


Загрузка...
Яндекс.Метрика Google+