При изучении строения и функции генов иммуноглобулинов были применены методы молекулярной биологии и генетической инженерии. Это позволило установить, что цепи иммуноглобулина кодируются генными сегментами , сгруппированными в кластеры. В процессе созревания В-лимфоцитов с определенных сегментов формируется единый ген, который экспрессируется в зрелых В-лимфоцитах. Необходимым условием для выяснения механизмов образования многообразие антител было выделение мРНК различных цепей иммуноглобулинов и сопоставления генома В-лимфоцитов с геномом других клеток организма. Получение мРНК тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов. Методы выделения мРНК основываются на фракционировании полирибосомних (полисомних) фракций с лизата клеток методом ультрацентрифугирования. Далее цепи мРНК можно очистить с помощью аффинного сорбента с олигодезокситимидином (олиго-ДТ-целлюлозы), который связывает мРНК благодаря наличию олигоаденилатнои последовательности в 3'-конце мРНК.

 

Следующим этапом является проведение in vitro экспрессии выделенной мРНК в бесклеточной трансляционном среде, содержит все необходимые для синтеза белка аминокислоты, тРНК, рибосомы, АТФ, ГТФ и т.д.. Для идентификации мРНК, кодирующих определенные цепи иммуноглобулинов, С. Тонегава впервые предложил использовать антиимуноглобулинови антисыворотки, которые связывают комплекс полирибосом с частично синтезированными цепями иммуноглобулинов.

 

Получение кДНК генов антител. С помощью обратной транскриптазы ретровирусов на матрице мРНК антител можно получить копии ДНК (кДНК). Далее получают двухцепную кДНК с помощью РНКазы Н, которая отщепляет рибонуклеотиды, и ДНК-полимеразы II Е.соЫ, что достраивает комплементарный цепь ДНК на одноцепной ДНК-матрицы.

 

Клонирование ДНК выделенных генов. Полученную кДНК можно клонировать, т.е. увеличить ее количество в сотни раз, с помощью соответствующего вектора Вектор - это молекула ДНК плазмиды или вируса, в которую можно встроить нужный ген для его переноса в другие клетки, например Е.сой. Этим способом было получено гены всех классов и подклассов иммуноглобулинов мышей и человека, т.е. образовано библиотеки этих генов.

 

В 1963 г. Арбер обнаружил явление рестрикции фагов. суть которого заключается в том, что производительность фага снижается в случае инфицирования им другого штамма бактерий. Изучение этого явления обусловило открытие у бактерий ферментов рестриктаз. которые разрезают чужеродную ДНК на фрагменты в определенных местах, содержащих соответствующую последовательность нуклеотидов. Некоторые рестриктазы расщепляют последовательность двухцепочечной ДНК с образованием так называемых «липких концов», которые способны соединяться с аналогичными «липкими концами» любых генов. Открытие рестриктаз позволило разработать подходы для генно-инженерных манипуляций с фрагментами ДНК, их специфического вырезания и встраивания в векторные молекулы.

 

Как правило, копии кДНК определенного гена встраивают в плазмиды, содержащие селективные гены устойчивости к антибиотикам. Поэтому в среде с соответствующим антибиотиком происходит рост только тех бактерий, которые получили плазмиду.

 

Плазмиды выделяют из лизата клеток после выращивания культуры с одной колонии, разрезают их рестриктазами и вырезают ген-вставку. Таким образом можно получить достаточное количество генов для анализа нуклеотидной последовательности.

 

Молекулярная, гибридизация. При нагревании раствора ДНК до точки плавления (95 - 96 ° С) ее цепи разделяются и остаются разделенными в случае быстрого охлаждения раствора. При температуре на 20 - 30 ° С ниже точки плавления происходит молекулярная гибридизация - специфическая реасоциация комплементарных одноцепочечных ДНК с образованием двухцепочечной молекул. Если к среде добавить радиоактивно меченые короткие ДНК-или РНК-зонды, которые комплементарные определенным участкам исследуемой молекулы ДНК, то с понижением температуры могут образовываться комплексы зонда с геномной ДНК. Скорость гибридизации зонда с геномной ДНК зависит от количества комплементарных зонда последовательностей в геномной ДНК. Результаты оценивают, измеряя радиоактивность фильтров после фильтрования через гидроксиапатит (гель фосфата кальция), который адсорбирует только двойные спирали ДНК.

 

Саузерн-блотинга (Sp?hen blotting). Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК позволяет определить размеры каждого исследуемого фрагмента. Для идентификации тех или иных генетических фрагментов, разделенных с помощью электрофореза, используют метод Саузерн-блотинга. Суть этого метода заключается в том, разделенных электрофорезом фрагменты ДНК переносят на мембрану и проявляют положение данного гена с помощью гибридизации с радиоактивно меченым зондом.

 

Для анализа методом Саузерн-блотинга плазмидную ДНК разрезают рестриктазы и в зависимости от вида рестриктазы получают определенное количество фрагментов ДНК. Фрагменты ДНК можно разделить в электрофоретическом гели согласно их размеров в связи с тем, что в геле мелкие фрагменты движутся быстрее. Разделенные фрагменты ДНК переносят на нитроцеллюлозную или нейлоновую мембрану, при этом сохраняется общая схема их взаимного расположения в геле. Положение данного гена на мембране определяют с помощью радиоактивного зонда, комплементарного этому гену. ДНК зонда, не связалась, отмывают, а связанную с геном определяют радиоавтография с использованием рентгеновской пленки.

 

Исследования С. Тонегавы, лежащие в основе современных представлений о реорганизации генов антигенспецифичних рецепторов. Первыми, кто привел убедительные свидетельства того, что в геноме В-лимфоцитов действительно происходит перестройка генов иммуноглобулинов, были С. Тонегава и Н. Хозуми (S. Tonegawa и N. Hozumi, 1976), которые работали вместе в Институте иммунологии в Базеле. Они с помощью рестрикционного анализа доказали, что в эмбриональных клетках и зрелых В-клетках (клетках миеломы) V-и С-гены расположены на разных расстояниях друг от друга. Этому открытию предшествовали несколько лет исследований матричной РНК легких цепей иммуноглобулинов, С. Тонегава начал в 1973 г. Ему удалось выделить мРНК легкой цепи иммуноглобулинов, провести его экспрессию в бесклеточной среде in vitro, расщепить с помощью рестриктаз кДНК на сегменты, кодирующие V- и С-части цепи, гибридизировать различные фрагменты кДНК с геномной ДНК и установить приблизительное количество копий V-генов в хромосоме.

 

Метод молекулярной гибридизации был использован С. Тонегава и соавт. (1974) для определения количества V-и С-генов в клетках миеломы мышей. С лизатов клеток миеломы они осаждали полисомы, из которых получали мРНК, кодирующей Х-цепи иммуноглобулинов. На матрице такой мРНК получали радиоактивно меченую комплементарную кДНК, которую использовали как зонд для определения количества Х-генов в геномной ДНК методом молекулярной гибридизации. В результате оказалось, что количество Vx-генов в гаплоидном наборе зародышевых клеток значительно меньше (примерно 25), чем предполагалось по теории «зародышевого многообразие». Однако из-за относительно высокой погрешность метода не удалось сделать точных выводов.

 

Методом Саузерн-блотинга при гибридизации меченой мРНК Х-цепи с расщепленной рестриктазами ДНК эмбриональных и зрелых лимфоидных клеток мышей было установлено, что в зрелых клетках V-и С-гены оказывались в одном рестрикционных фрагментов, а в эмбриональных клетках - в разных. В опытах использовали клетки миеломы - опухолевой линии В-клеток, которые лучше культивируются in vitro. Таким образом было доказано, что в эмбриональных клетках V-и С-гены расположены на большом расстоянии (свыше 5 тыс. пар оснований), а в геноме зрелых В-клеток в процессе созревания они объединяются в единый функциональный ген, однако все же остаются разделенными примерно 1250 парами некодирующих нуклеотидов. Итак, в ходе перестройки генов иммуноглобулинов во время созревания В-клеток происходят делеции значительной части ДНК, размещенной между соответствующими генными фрагментами. Такие делеции происходят вследствие гомологичной рекомбинации между полиндромнимы последовательностями, которые фланкирующих (окружающих) каждый генный сегмент.

 

Клонирования генов Х-цепей неожиданно выявило, что участки ДНК, кодирующей последние 13 аминокислот (последовательность 96-108) вариабельных доменов Х-цепей, в зародышевых V-генах нет. Этот затерянный маленький фрагмент кодирующей последовательности ДНК были найдены на расстоянии нескольких тысяч пар нуклеотидов от конца V-гена и за 1300 килобаз перед С-геном и назван J-геном (от англ. Joining - соединительный ген). Итак, вариабельный домен легких цепей иммуноглобулинов формируется из двух генных сегментов - V-и J-, которые определенным образом объединяются с С-геном во время созревания лимфоцитов. Это открытие Тонегавы и Брек стало существенным дополнением к модели, предложенной Дрейера и Беннетом. Аналогичными методами доказано, что формирование генов, кодирующих V-домены тяжелых цепей, идет из трех независимых генетических сегментов - V, D и J. В 1987 p. C. Тонегава получил Нобелевскую премию в области физиологии и медицины за открытие «генетических принципов образования разнообразия антител» (for the discovery of the genetic principle Jor generation of antibody diversUy).


Загрузка...
Яндекс.Метрика Google+