Фрагментация энзимами. В 1959 г. Р. Портер, исследуя расщепления кроличьего IgG (содержащий только один дисульфиидний связь между тяжелыми цепями) протеолитическим ферментом растительного происхождения папаином при наличии цистеина, выявил снижение его молекулярной массы с 7S до 3,5 S. Во время диализа этого материала по сравнению с фосфатным буфером и фильтрации на колонке с карбоксиметилцеллюлозой (рН = 5,2) было получено три пика - фрагменты I, II, III, имевшие молекулярную массу по 50 000. Из них 2/3 составляли фрагменты I и II, а 1/3 - фрагмент III. Фрагменты I и II имели активность моновалентных антител, то есть связывали антиген (Fab), а фрагмент III антиген не связывал (Fc). Позднее А. Нисонов с сотрудниками (1960) расщепили кроличий IgG пепсином при отсутствии цистеина и доказали, что молекулярная масса полученного продукта снижается до 100 000. Этот продукт должен активность двухвалентных антител. Под действием бромциан молекула IgG расщеплялась на большое количество пептидов.

 

Используя для разрушения мижланцюгових дисульфидных мостиков цистеин при наличии мочевины или гуанидина, Д. Эдельман с сотрудниками (1960) показали, что в случае разрушения S - S-связей молекулярная масса Y-глобулинов снижается с 150 000 до 50 000, а при хроматографическом исследовании материала было обнаружено компоненты с молекулярной массой 25 000. Это позволило утверждать, что молекула кроличьего IgG должен состоять из четырех цепей - двух по 50 000 и двух по 25 000. В 1962 p. P. Портер на основе данных расщепления кроличьих иммуноглобулинов меркаптоэтанолом предложил схему структуры IgG, согласно которой молекула иммуноглобулинов состоит из четырех цепей - двух тяжелых Н (hard) и двух легких L (light). Тяжелые цепи соединены между собой и с легкими цепями дисульфидными связями. Связи между тяжелыми цепями локализуются примерно посередине, в области,, которую называют шарнирной. Она отличается относительно лабильной структурой, приводит гибкость молекулы, возможность вращения отдельных ее субъединиц и характеризуется высокой чувствительностью к протеолитических ферментов. В случае расщепления IgG папаином в шарнирной области молекула иммуноглобулина распадается на три фрагмента - два одинаковых Fab-фрагменты, состоящие из легкого и около половины тяжелой цепи, соединенных S-S-связью, и один Fc-фрагмент, состоящий из двух половинок тяжелых цепей, соединенных S-S-связью (рис. 36). С помощью анализа аминокислот в тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов выявлено константные части характеризуются постоянством аминокислотного состава, и вариабельны, которым присуща значительная изменчивость аминокислот. По составу и последовательностью аминокислот в константной части тяжелых цепей различают иммуноглобулины пяти классов: IgM, IgG loA IgE IsD. Константа седиментации F (ab) 2-фрагмента составляет 5S (молекулярная масса 100 000), а Fab-фрагмента - 3,55 (молекулярная масса 50 000). Рецепторная группа антител разрушается при расщеплении цепей полипептидов. Под влиянием восстановительных веществ - 0,01 М раствора цистеина, 0,01 М раствора меркаптоэтанол F (ab) 2-фрагмент может распадаться на два Fab-фрагмента, которые уже не осаждают антиген, однако могут связывать гаптен и тормозить реакцию антигена с антителом. Эти фрагменты одновалентные и гомологичные с папаиновимы Fab-фрагментами I и II, но их Fd-фрагмент примерно на десять аминокислотных остатков больше.

 

Антитела двумя рецепторными группами различной специфичности не синтезируются, однако их можно получить, расщепляя пепсином смеси антител двух разных видов с последующим восстановлением и окислением. В таком случае возможны случайные сочетания двух различных Fab-фрагментов. F (ab) 2-фрагмент, образующийся при этом, способен связываться с антигеном и образовывать преципитаты при наличии в смеси обоих антигенов. Результаты этих исследований показали, что отдельные Fab-фрагменты антител моновалентные, тогда как F (ab) 2-фрагменты и молекулы IgG-антител двухвалентные. Fc-фрагмент. Фрагмент Fc - это сообщающиеся дисульфидными связями остатки двух тяжелых цепей после отщепления Fab-фрагментов папаином. Fc-фрагмент молекулы IgG имеет молекулярную массу 50 000. При отщеплении фрагмента F (ab) 2 пепсином из остатков тяжелых цепей, не вошедшие в его состав, образуется Fc-фрагмент. Антигенные детерминанты, специфические для каждого из классов и подклассов иммуноглобулинов, которые не дают перекрестных реакций с антисыворотки против других классов, размещены преимущественно в Fc-фрагменте. Антисыворотки к Fc-фрагмента кроличьего IgG в реакции преципитации реагирует с тяжелыми, но не реагирует с легкими цепями, т.е. в составе Fc-фрагмента нет остатков легких цепей.

 

Fc-фрагмент не связывается с антигеном, поскольку не содержит рецепторных групп. Отщепление Fc-фрагмента не влияет на специфическую антигензвьязувальну активность молекулы антитела. Fc-фрагмент содержит цитофильну часть обеспечивает связь целой молекулы антитела с клетками. От Fc-фрагмента зависят эффекторные функции антител: способность связывать комплемент, обеспечивать фиксацию антител на Цитомембрана, индуцировать возникновение анафилактических реакций, обеспечивать проникновение антител через плаценту. Способность Fc-фрагмента фиксировать комплемент определяется его КН2-конечной участком, примыкающим к Fd-фрагмента. От Fc-фрагмента зависит индекс катаболизма иммуноглобулинов и уровень антител в крови. На участке Fc-фрагментов есть структуры, с помощью которых антитела соединяются с Fc-рецепторами клеток. Эти структуры находятся в Си3-СН4-доменах и, если они находятся в изолированном виде, то сохраняют способность связываться с рецепторами - конкурируют с антителами за Fc-рецепторы клеток. В Fc-фрагменте молекулы антитела может быть два или три центра для связывания с разными типами клеток. Это участки полипептидной Н-цепи, состоящие из 4 - 10 остатков аминокислот Иммуноглобулины, как и другие белки сыворотки крови, в клубочках почек фильтруются в первичную мочу. В извитых канальцах почек они реабсорбируются. Этот процесс, возможно, обусловлено наличием на эпителии канальцев рецепторов для Fc-фрагментов, поскольку ни Fab-, ни F (ab) 2-фрагменты не реабсорбируются.

 

Фрагменты Fab и Fc - компактные образования, между которыми в молекулах IgG и IgA размещены гидратированные участка тяжелой цепи, благодаря чему молекулы этих иммуноглобулинов состоят из трех субъединиц, которые независимо вращаются вокруг шарнирной участка, размещенной в центре молекулы, и имеют гибкую структуру (табл. 27) Легкие цепи. Если у-глобулины обработать меркаптоэтанолом в концентрированном растворе мочевины, дисульфидные связи разрушаются и молекула антитела распадается на отдельные два легких L-и два тяжелых Н-полипептидные цепи. В легких и тяжелых цепях различают NH2-т СООН-концевые части. L-цепи, которые были получены из цепей разных классов, способны рекомбинуватися как с гомологичными, так и гетерологичных Н-цепями. Легкие цепи бывают двух типов: к-(каппа) и Х-(ламбда). Однако в одной молекуле антител оба цепи могут быть только однозначными - или к-или Х-. Они различаются между собой по аминокислотному составу в С-концевой области и по антигенным свойствам. У человека в молекулах IgG к-цепи составляют 70%, а Х-цепи - 30%. В сыворотке лошадей 95% легких цепей относится к Х-, у мышей - к к-типа. У человека конечная NH2-аминокислота Х-цепей заблокирована пиролидонкарбоновою кислотой (циклическая производная глутаминовой кислоты), а в к-цепях в этом положении находится аспарагиновая кислота. В С-концевой части L-цепей размещен цистеин, сочетается дисульфидные мостики с цистеином Н-цепи. Цепь Х состоит из 213 -216, а цепь к - с 214 - 219 остатков аминокислот. Молекулярная масса легких цепей составляет 23 000 - 25 000.

 

Среди иммуноглобулинов одного класса оказываются, как правило, молекулы антител с легкими цепями обоих типов. Каждый тип легких цепей имеет специфическую первичную полипептидную структуру, и их синтез контролируется определенным образом.

 

В легком цепи содержится относительно большое количество глицина, имеющий инвариантное положение в антител разных видов и различной специфичности. Гибкость полипептидной цепи в области, где содержится много глицина, способствует формированию антигензвьязувального центра. Тяжелые цепи. У человека соответственно каждому классу иммуноглобулинов (М, G, A, D, Е) различают пять типов тяжелых цепей, которые обозначают греческими буквами д (мю), у (гамма), а (альфа), 8 (дельта) и s (эпсилон). Тяжелые цепи ковалентно соединены между собой и с одним легким цепью дисульфидными мостиками. Каждый тип Н-цепей в молекуле антитела соответствующего класса связывается с одним из типов L-цепей. Итак, структуру молекулы иммуноглобулина класса G можно изобразить так: к-у-у-к-или Х-у-у-Х. Тяжелые цепи иммуноглобулинов человека имеют молекулярную массу в пределах 50 000 - 70 000. Они различаются между собой по аминокислотному составу и антигенным свойствам. Тяжелые цепи IgG состоят из 446, IgA - с 460 - 470, a IgM, IgD и IgE - с 550-570 аминокислотных остатков.

 

Изолированные тяжелые цепи антител и даже Fd-участка сохраняют способность связываться с гомологичным антигеном, хотя по сравнению с интактными молекулами их активность ниже. Способность тяжелых цепей взаимодействовать с антигеном повышается в том случае, когда они соединены с легкими цепями. Это позволяет считать, что активный центр антител образован как легким, так и тяжелым цепями. Считают, что легкий цепь стабилизирует рецепторные структуры тяжелой цепи в положении, которое доступно для детерминанты антигена.


Загрузка...
Яндекс.Метрика Google+