Г. Корана

Генная инженерия - отрасль молекулярной биологии и генетики, задача которой - конструирование генетических форм и структур по заранее намеченному плану, создание организмов с абсолютно новой генетической программой. Возникновение генной инженерии стало возможным благодаря данному синтезу методов и идей молекулярной биологии, генетики, биохимии и микробиологии. Основные принципы генной инженерии были разработаны в 60-70-х годах XX столетия. Они включали три основных этапа:
а) получения генетического материала (искусственный синтез или выделения природных генов),
б) включение этих генов в генетическую структуру, которая реплицируется автономно (векторную молекулу ДНК), то есть создание рекомбинантной молекулы ДНК, в) введение векторной молекулы (с включенным в нее геном) в клетку-реципиент, где она монтируется в хромосомный аппарат.

Экспериментальное переноса генов в другой геном называется трансгенезом. Он основывается на технологии рекомбинантной ДНК. В основе генной инженерии лежат различные методы манипуляций с молекулами ДНК.

Генная инженерия. Получения генетического материала. В современной генетике используются два способа синтеза генов вне организма - химический и ферментативный. Для химического синтеза необходимо иметь полностью расшифрованную последовательность нуклеотидов ДНК. Впервые искусственный ген синтезировал индийский ученый Г. Корана (1970). Это был ген ала- Нинов тРНК дрожжей, который состоял из 77 нуклеотидов. В первых опытах он не проявлял функциональной активности, поскольку не имел регуляторных участков. В 1976 г. удалось синтезировать ген тирозинових тРНК кишечной палочки, который складывается не только из структурной участка (126 нуклеотидных пар), но и всех регуляторных частей – терминатора и промотора. Этот искусственно созданный по специальной программе ген был трансплантированных в бактериальную клетку и функционировал как естественный. Генная инженерия.

Другим примером химического синтеза является синтез гена, кодирующего фермент расщепления лактозы. Синтезирован в пробирке ген был встроен в плазмеда и введен в бактерию; кишечная палочка приобрела способности усваивать лактозу. Однако химическим путем можно синтезировать небольшие по размеру гены прокариот. Синтез генов эукариот, состоящих из тысячи больше нуклеотидов, путем химического синтеза создать пока не удалось.
Ферментативный синтез генов осуществляется с помощью процесса обратной транскрипции. Открытие этого процесса сделано на пухлиноутворюваль- них РНК-содержащих вирусах. Однако впоследствии оказалось, что передача генетической информации с иРНК на ДНК может происходить в условиях эксперимента и с другими РНК. Именно это лежит в основе ферментативного синтеза гена. Генная инженерия

Упрощенно это можно представить следующим образом: в пробирке на матрице иРНК с помощью фермента обратной транскриптазы (ревертазы) синтезируется комплементарная к ней нить ДНК, затем образуется двухниточный молекула ДНК. После этого иРНК разрушается ферментом рибонуклеаза, полученную ДНК называют ДНК-копии (кДНК). Такая кДНК не имеет вставок-интронов, т.е. схема ее строения не отличается от бактериального гена. Матричную (информационную) РНК (мРНК) выделяют из клеток или тканей, в которых экспрессируется нужен ген. Так, для клонирования проинсулинового гена используют B-клетки поджелудочной железы, потому что именно для них характерно высокое содержание проинсулиновои мРНК.
Ген, полученный вследствие ферментативного синтеза, может функционировать в бактериальной клетке. На нем синтезируется иРНК, а затем белок. Под руководством В. Энгельгардта был получен ген, который определяет синтез фермента галактозидазы. Этот ген вводили в фаг, при размножении которого в клетке получили множество разнообразных копий, что дало возможностьсделать синтез большого количества фермента. Это имеет не только теоретическое, но и практическое значение для всех, так как галактозидаза применяется в пищевой промышленности.

Синтезированы гены глобина человека, кролика, голубя, некоторые гены митохондрий печени крыс и многие другие. Гены, синтезированные с помощью ревертазы, не имеют регуляторной части и промотора. Отсутствие регуляторных участков препятствует функционированию этих искусственных генов в животных клетках.
Генная инженерия при переносе в микробную клетку к структурным генов экспериментально, с помощью ферментов, присоединяют промотор, который добывают из микробной клетки. Так были синтезированы два гена, ответственные за синтез цепей инсулина. их вводили в геном кишечной палочки, которая начала производить инсулин. Важным достижением генной инженерии является синтез гена соматостатина, который может функционировать в микробной клетке. Таким же методом под руководством Ю. А. Овчинникова и Н. П. Дубе - Пронина осуществлен синтез генов, кодирующих нейрогормоны человека (лейцин-энкефалин и брадикинин). Ферментативный синтез генов имеет большое значение, потому что принципиально возможно проводить искусственный синтез любых индивидуальных генов путем транскрибирования их из соответствующих матричных РНК. Основным препятствием является синтез не структурных, а регуляторных частей генов, необходимых для их нормальной работы. Это в основном ограничивает использование искусственно синтезированных генов. В генной инженерии широко используют так Также и выделение естественных генов с целью создания рекомбинативних молекул ДНК.
Включение полученного гена в вектор. Вектор - это нечто вроде молекулярного "Такси", способного переносить чужую ДНК внутрь бактериальной клетки таким образом, чтобы она там смогла реплицироваться. Существует два основных типа векторов: бактериальные плазмиды и бактериофаги. После выделения или синтеза гена его сшивают с векторной (направляющей) молекулой ДНК. С этой целью используют особые бактериальные ферменты. Такие ферменты у бактерий, в которых они останавливают репродукцию вируса, вырезая вирусную ДНК из генома бактерии. Они называются рест- риктазамы, поскольку ограничивают размножение вирусов. Каждый тип ферментов рестрикции, а их известно около 100, разделяет ДНК в специфическом месте, что называется сайтом рестрикции. В промежутке, появившемся может быть размещена участок чужеродной ДНК. Такое ДНК можно разрезать с помощью того же фермента рестрикции. Одноцепочечные комплементарные концы двух ДНК называют "Липкими концами", так как они соединяются вследствие комплементарного спаривания азотистых оснований. Они облегчают вставку чужеродной ДНК в векторную.

Таким образом, можно сочетать отрезки ДНК, полученные из разных источников, и создавать комбинации генов в одной длинной молекуле. Поскольку водородные связи легко разрываются, для соединения участков применяют фермент лигазы - один из ферментов репарации. Комбинируя различные рестриктазы и лигазы, можно разрезать нить ДНК в разных местах и получать рекомбинантные молекулы (например, плазмидную ДНК со встроенным чужим геном. Встраивания в геном реципиента.

Векторные молекулы, содержащие в себе фрагменты чужеродной ДНК, должны обладать свойством, которое обеспечивает третий этап генной инженерии – проникновение в клетку-реципиент и встраивания в ее геном. Реципиентного клетки, т.е. клетки, выбранные для клонирование гена, могут быть как про-, так и эукариотических. Чаще всего для этой цели используют бактерии, поскольку их легко получать в больших количествах. Перенос генов может осуществляться из одной бактерии в другую с помощью плазмид. Рекомбинантные молекулы ДНК отделяют от молекул, содержащих только донорскую или только плазмидную ДНК. Для их разделения используется плазмида, что два гена устойчивости к двум определенных антибиотиков. При этом клетки, растущие при наличии двух антибиотиков, содержащих только исходную плазмиду. Клетки, гибнут под действием двух антибиотиков, лишенные плазмид и содержат только донорскую ДНК. Клетки, растущие при наличии одного антибиотика и гибнут при наличии другой, - содержат рекомбинантную плазмида.

 


Загрузка...
Яндекс.Метрика Google+